Dokument: Physiologie, Sekretion und Biotechnologie zweier Autotransporterproteine aus Pseudomonas Spezies

Titel:	Physiologie, Sekretion und Biotechnologie zweier Autotransporterproteine aus Pseudomonas Spezies
Weiterer Titel:	Physiology, secretion and biotechnology of two autotransporterproteins from Pseudomonas species
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=12245
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090731-125039-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Sabrina Schell [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,20 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.07.2009 / geändert 25.07.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof.Dr. Joachim F. Ernst [Gutachter]
Stichwörter:	Autotransporterproteine, Membranproteine, Pseudomonas
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Esterase EstA aus Pseudomonas aeruginosa ist ein Autotransporterprotein, dessen Transportdomäne eine β-Pore in der äußeren Membran bildet, um die Passagierdomäne an die Zelloberfläche zu transportieren. Anhand eines Strukturmodells wurde postuliert, dass nach dem Transport die Passagierdomäne durch eine α-Helix im Lumen der Pore mit der Transportdomäne verbunden bleibt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese α-Helix essenziell für EstA ist. Die Konstruktion der Deletionsmutante EstAΔH war nur unter Bedingungen möglich, bei denen keine Expression erfolgte. Eine Produktion des Proteins konnte nur stattfinden, wenn die Zellen EstAΔH in denaturierten Aggregaten in Form von inclusion bodies exprimierten. Ein weiteres gemeinsames, charakteristisches, strukturelles Merkmal von Autotransporter-proteinen sind meist zwei nahe beieinander liegende Cysteine in der Passagierdomäne. Trotz der extremen Diversität der Aminosäuresequenzen dieser Domänen, welche die verschiedensten Funktionalitäten widerspiegeln, sind diese Cysteinreste in fast allen Autotransporterproteinen vorhanden, sodass ihnen eine besondere Bedeutung zugesprochen wird. Bei EstA befinden sich diese Aminosäuren an Position 258 und 264. Jedoch konnte bei EstA den Cysteinresten keine offensichtliche Funktion zugeordnet werden, weder bei der Sekretion noch bei der Enzymaktivität. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Substitutionen C258S und C264S einen Einfluss auf die in vitro-Faltung von EstA haben. Fast alle der bisher beschriebenen Autotransporterproteine stammen aus pathogenen Organismen und werden mit der jeweiligen Virulenz assoziiert. Die Autotransporterproteine sind jedoch nicht nur in virulenten Mikroorganismen zu finden. Anhand von Sequenzhomologien konnte in P. putida KT2440 nun eines der ersten Autotransporterproteine aus einem nicht-pathogenen Bakterium identifiziert werden. Das Protein, das der offene Leserahmen PP0418 kodiert, ist der Esterase EstA aus P. aeruginosa sehr ähnlich und wurde als EstP bezeichnet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde EstP charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Passagierdomäne, im Gegensatz zu den meisten anderen bekannten Autotransporterproteinen, auf der Zelloberfläche verbleibt. Folglich ist es möglich, basierend auf dem Transportmechanismus, EstP auch als Autodisplaysystem einzusetzen, um heterologe Proteine auf der Oberfläche zu präsentieren. Bei der Charakterisierung der Esterase EstP konnte neben einer esterolytischen Aktivität auch eine Phospholipase B-Aktivität beschrieben werden. Um die physiologische Bedeutung des ersten Autotransportproteins in einem avirulenten Stamm analysieren zu können, wurde der estP-defiziente Stamm P. putida KT0418 konstruiert. Es wurde eine Auswahl an Phänotypen der estP-Negativmutante untersucht, wobei es nicht gelang, unter den gewählten Bedingungen, Hinweise auf die physiologische Funktion von EstP in P. putida KT2440 zu finden. Esterasen gewinnen in der organischen Chemie und Biotechnologie zunehmend an Bedeutung durch ihr breites Substratspektrum, Stabilität in organischen Lösungsmitteln und insbesondere durch ihre Kofaktorunabhängigkeit. Obwohl die Gewinnung von enantiomeren-reinen Verbindungen für die Pharmaindustrie von großem Interesse ist, existieren nur wenige Beispiele für erfolgreich durchgeführte Modifikationen von Esterasen zur Steigerung der Enantioselektivität. EstP zeigte keine Präferenz gegenüber den Enantiomeren der 2-Methyldekansäure. Durch gerichtete Evolution konnte in dieser Arbeit eine enantioselektive Variante der Esterase EstP erzeugt werden. Die Variante EstP W173R führte zu einer Verschiebung der Enantioselektivität mit einer Präferenz gegenüber dem R-Enantiomer der 2-Methyldekansäure mit einem Etrue-Wert von 20. Da die Interpretationen der Auswirkungen von Aminosäureveränderungen aufgrund der fehlenden Kristallstruktur von EstP höchst spekulativ sind, wurde die Effizienz der Expression und Reinigung von EstPN sowie deren enantioselektiver Variante EstPN W173R optimiert. Somit konnte gereinigtes Protein in homogener Form für Kristallisations-experimente zur Strukturaufklärung zur Verfügung gestellt werden. Interessanterweise ergab sich aus den Analysen zur Enantioselektivität von EstP ein Unterschied bei den optimalen Hydrolysebedingungen zwischen Volllängenprotein und der katalytisch aktiven Domäne. Dies ist einer der ersten experimentellen Hinweise darauf, dass die Interaktionen zwischen beiden Autotransporterdomänen zu Veränderungen der Enzymaktivität führen können. Bislang gibt es keine Strukturdaten, womit mögliche molekulare Interaktionen zwischen Passagier- und Transportdomäne erklärt werden können. Um weitere experimentelle Hinweise für potenzielle Struktur-Funktions-Beziehungen zu bekommen, wurden in dieser Arbeit Chimäre zwischen den beiden Autotransporterproteinen EstA und EstP konstruiert und analysiert. Sowohl in P. putida als auch in P. aeruginosa wurden nach der Expression Unterschiede zwischen den Chimären EstANEstPC und EstPNEstAC im Vergleich zu den Wildtypproteinen EstA und EstP bezüglich der Sekretion und Aktivität beobachtet. Die vier Enzyme zeigten auch nach einer in vitro-Faltung unterschiedliche Aktivitäten gegenüber p-Nitrophenol-Estern mit verschiedenen Kettenlängen. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die potenziellen molekularen Interaktionen zwischen der Passagier- und der Transportdomäne von Autotransporterproteinen zur Modulation der Funktionalität führen. The esterase EstA from Pseudomonas aeruginosa is an autotranporter protein. Its translocator domain forms a β-barrel in the outer membrane to transport its passenger domain to the cell surface. Based on a structural model it was postulated that after transport the passenger domain remains connected by an α-helix in the lumen of the pore. Indeed, in this study it could be shown that an amino acid sequence encoding a potential α-helix is essential for EstA production and activity. The construction of the deletion mutant estAΔH was only possible under conditions without any expression. The production of the protein EstAΔH was successful only when the cells deposited the protein in inclusion bodies. Another common characteristic structural feature of autotransporter proteins are two cysteines located in close vincinity with the passenger domain. Despite the extreme diversity of these domains, which reflect a variety of functions, these cysteine residues are present in almost all autotransporter proteins, so that they might have special relevance. These cysteines are located at positions 258 and 264 in EstA and could neither be related to the secretion process nor to the EstA activation in vivo. Nevertheless, it was shown that the mutants which carried cysteine substitutions influenced EstA in vitro refolding. Almost all autotransporter proteins described so far originated from pathogenic organisms and they are associated with virulence. But the autotransporter proteins are not limited to virulent microorganisms. On the basis of sequence homologies we could identify for the first time an autotransporter protein from the non pathogenic bacterium P. putida KT2440. The protein, which is encoded by the open reading frame PP0418, is very similar to the esterase EstA from P. aeruginosa and was named EstP. In this study EstP has been characterized and it could be shown that the passanger domain remains attached on the cell surface in contrast to most of the other known autotransporter proteins. Therefore, based on the transport mechanism, it is possible to adopt EstP as display system to present heterologous proteins on the cell surface. During the characterization it was found that EstP exhibits, beside its esterase activity, also phospholipase B activity. The estP-deficient strain P. putida KT0418 was generated to analyse the physiology. A range of phenotypes of the estP-negative mutant are analyzed, but under the chosen conditions it was not possible to find any phenotypic alterations. Esterases are of increasing importance for organic chemistry and biotechnology applications due their broad substrate specificity, stability in organic solvents and independence of essential cofactors. There are only few examples of successful modifications of esterases to increase the enantioselectivity, although the production of pure enantiomeric compounds is of great interest for the pharmaceutical industry. EstP showed no preference towards one of the enantiomers of the substrate 2-methyldecanoic acid. In this study, an enantioselective variant of the esterase EstP was created successfully. The variant EstP W173R generated by directed evolution showed a shift to preferential hydrolysis the R-enantiomer of the 2-methyldecanoic acid with an Etrue-value of 20. Since the interpretations of amino acid exchange effects are highly speculative due to the lack of a crystal structure of EstP, the efficiency of expression and purification of EstPN and the enantioselective variant EstPN W173R were optimized. Thus, purified protein was provided for crystallization experiments and structure determinations. Interstingly, the analysis of the enantioselectivity of EstP resulted in a difference between the whole protein and the catalytic active domain with respect to the optimal conditions for their hydrolysis. This is the first experimental evidence that interactions between the two autotransporter domains could change the enzyme activity. So far, there are no structural data, that could explain the possible molecular interactions between the passenger and transport domain. In this study, chimeras between the autotransporter proteins EstA and EstP were constructed and analyzed to get further experimental evidence for potential structure-function-relationship. After expression in both P. putida and P. aeruginosa, differences were observed between the chimeras EstANPC and EstPNAC concerning the secretion and activity. The four enzymeconstructs vary in the specific activities towards p-nitrophenol esters with different chain lengths, according to a production in form of inclusion bodies and in vitro folding. These results clearly show that the potential molecular interactions between the passenger and transport domain of the autotransporter proteins result in a modulation of their functionality.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	31.07.2009
Dateien geändert am:	25.07.2009
Promotionsantrag am:	19.05.2009
Datum der Promotion:	24.06.2009