Dokument: Autodisplay humaner Hyaluronidasen und Entwicklung von Verfahren zur Testung von Inhibitoren

Titel:	Autodisplay humaner Hyaluronidasen und Entwicklung von Verfahren zur Testung von Inhibitoren
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=12130
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090819-111157-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kaeßler, Andre [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,51 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.07.2009 / geändert 15.07.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Jose, Joachim [Gutachter] Prof. Dr. Kassack, Matthias U. [Gutachter]
Stichwörter:	Hyaluronidase, Hyaluronsäure, stains-all
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Eine übermäßige Expression der humanen Hyaluronidasen hHyal-1, hHyal-2 und hPH-20 steht in Zusammenhang mit Erkrankungen wie Arthrose, Blasen-, Brust- und Prostatakrebs. Für die Suche nach Inhibitoren werden größere Mengen an humanen Hyaluronidasen benötigt, die bisher jedoch in Escherichia coli nur nach Aufreinigung aus „inclusion bodies“ und in geringem Umfang gewonnen werden können. Um diesen Mangel zu beseitigen, wurden in der vorliegenden Arbeit erstmals humane Hyaluronidasen mittels Autodisplay in katalytisch aktiver Form auf der Oberfläche von E. coli F470 exprimiert. Es wurden zudem ein „stains-all“ Testverfahren sowie ein Morgan-Elson Testverfahren mit Rinderhyaluronidase (BTH) auf ihre Verwendbarkeit zur Messung von Hyaluronidase-Aktivität bei pH 3,5 und pH 7 untersucht und für die Verwendung in Mikrotiterplatten optimiert. Durch Erhöhung der Sensitivität konnte zum ersten Mal ein „stains-all“ Testverfahren zur Bestimmung von HA bei pH 3,5 sowie in Anwesenheit von Zellen durchgeführt werden. Die Enzymkonzentrationen an humanen Hyaluronidasen auf der Oberfläche von E. coli F470 waren ausreichend hoch, um diese Zellen mit dem „stains-all“ Testverfahren zu kombinieren. Die gemessene Aktivität der hHyal-1 betrug 87 mU/ml bei pH 3,5, bei pH 7 konnte keine Aktivität ermittelt werden. Die Aktivität der hHyal-2 erreichte 62 mU/ml bei pH 3,5 und 400 mU/ml bei pH 7, die von hPH-20 28 mU/ml bei pH 3,5 und 582 mU/ml bei pH 7 bei einer OD578 nm = 5. Zur Prüfung der Testverfahren auf ihre Verwendbarkeit zur Suche nach neuen Leitstrukturen von Hyaluronidase-Inhibitoren wurden mehrere Benzoxazol-, Benzimidazol- und Indol-Derivate auf eine Hemmung von BTH untersucht. Von diesen Verbindungen zeigte N-[1-(4-Fluorobenzyl)indol-3-yl]-2-(4-fluorophenyl)-acetamid (SO17) mit IC50-Werten von 57 µM bei pH 3,5 bzw. 26 µM bei pH 7 die höchste inhibitorische Potenz und es konnten Struktur-Wirkungs-Beziehungen abgeleitet werden. Noch stärker inhibitorisch aktiv war das als Kontrollinhibitor verwendete Ascorbinsäurepalmitat (Vcpal) mit IC50-Werten von 18 µM bei pH 3,5 und 8 µM bei pH 7. In der Gruppe der Indol-3-acetamide wiesen einige Verbindungen deutliche Hyaluronidase-aktivierende Fähigkeiten auf. Den stärksten Effekt übte N-(4,6-Dimethylpyridin-2-yl)-(1-ethylindol-3-yl)acetamid (MD9) mit einer Steigerung der BTH-Aktivität auf 134% bei 100 µM aus. Ascorbinsäurepalmitat sowie SO3 und SO16 wurden anschließend im „stains-all“ Testverfahren mit Hyaluronidase-tragenden Zellen bei pH 7 auf ihre inhibitorischen Fähigkeiten von hHyal-2 und hPH-20 getestet. Auf hPH-20 wirkte Vcpal ähnlich stark inhibierend als auf BTH, SO3 und SO16 waren jedoch nur etwa halb so stark inhibitorisch aktiv. Gegenüber hHyal-2 wirkten Vcpal und SO3 etwas halb so stark inhibierend wie gegen BTH, während die Hemmung durch SO16 in derselben Größenordnung lag. Durch die Kombination der in dieser Arbeit vorgestellten Zellen, die humane Hyaluronidasen mittels Autodisplay auf ihrer Oberfläche tragen, mit dem optimierten „stains-all“ Testverfahren wird eine einfachere Suche nach Hyaluronidase-Modulatoren humaner Hyaluronidasen möglich sein. Overexpression of the human hyaluronidases hHyal-1, hHyal-2 and hPH-20 is involved in the pathogenesis of severe diseases like arthrosis or bladder, breast and prostate cancer. The search of hyaluronidase inhibitors requires sufficient quantities of human hyaluronidases for successful screening, but until now they are obtained only with low yield using Escherichia coli due to purification from inclusion bodies. To overcome the lack of human hyaluronidases, in this work for the first time human hyaluronidases hHyal-1, hHyal-2 and hPH-20 were expressed catalytically active on the surface of Escherichia coli using the Autodisplay system. Furthermore, a stains-all assay and a Morgan-Elson assay using bovine testes hyaluronidase (BTH) were tested for hyaluronidase activity measurement at pH 3.5 and pH 7. Both assays were optimized for the use in microplates. An enhancement of sensitivity was achieved and allowed determination of HA using a stains-all assay also at pH 3.5 and in the presence of cells for the first time. The enzyme concentrations of human hyaluronidases on the outer surface of E. coli were sufficient for a use within the stains-all assay. The activity of hHyal-1 was determined as 87 mU/ml at pH 3.5. At pH 7 no activity was found. The activity of hHyal-2 was determined as 62 mU/ml at pH 3.5 and 400 mU/ml at pH 7 whereas hPH-20 showed an activity of 28 mU/ml at pH 3.5 and 582 mU/ml at pH 7. All activities were obtained using cell suspension with an OD578 nm = 5. In order to verify the practicability of the test procedures for the identification of new hyaluronidase inhibitors, several benzoxazole-, benzimidazole- and indole-derivatives were successfully tested for their BTH inhibiting capabilities. Structure-activity-relationships could be concluded and N-[1-(4-Fluorobenzyl)indole-3-yl]-2-(4-fluorophenyl)-acetamide (SO17) showed the highest inhibitory potency of these derivatives with IC50-values of 57 µM at pH 3.5 and 26 µM at pH 7. Ascorbic acid palmitate, which was used as a control inhibitor, was much more inhibitory active. It showed IC50-values of 18 µM at pH 3.5 and 8 µM at pH 7. Within the derivatives of the indole-3-acetamides, several compounds showed hyaluronidase activating capabilities. N-(4,6-Dimethylpyridine-2-yl)-(1-ethylindole-3-yl)acetamide (MD9) revealed the highest effect with an activation up to 134% at a concentration of 100 µM. Ascorbic acid palmitate as well as SO3 and SO16 were also tested for their inhibitory capabilities of hHyal-2 and hPH-20 in the stains-all assay using whole cells at pH 7. Against hPH-20, Vcpal was as active as against BTH, but SO3 and SO16 were approximately half active. Against hHyal-2, Vcpal and SO3 showed about half inhibitory activity than against BTH, but the inhibitory potency of SO16 was in the same order of magnitude. Due to the combination of cells expressing human hyaluronidases on their outer surface using Autodisplay and the optimized stains-all assay, this work enables easier hyaluronidase modulator screening.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie
Dokument erstellt am:	19.08.2009
Dateien geändert am:	15.07.2009
Promotionsantrag am:	22.06.2009
Datum der Promotion:	09.07.2009