Dokument: DNA Hypomethylierung und Genexpression in Blasenkarzinoma

Titel:	DNA Hypomethylierung und Genexpression in Blasenkarzinoma
Weiterer Titel:	DNA hypomethylation and Gene Expression in Bladder Cancer
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=12107
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090714-103501-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr.rer.nat Dokun, Olusola Yakub [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,98 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.07.2009 / geändert 13.07.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Schulz, Wolfgang A. [Betreuer/Doktorvater]
Stichwörter:	DNA hypomethylation, Bladder cancer, Gene Expression
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In menschlichen Tumoren kommen zwei verschiedene Arten von Veränderungen der DNA-Methylierung vor. Einerseits werden CpG-reiche Sequenzen um den Transkriptionsstart einzelner Gene, die sonst niemals methyliert sind, aberrant hypermethyliert. Andererseits werden ansonsten in normalen Geweben dicht methylierte Sequenzen wie CpG-reiche Satelliten und Retrotransposone, hypomethyliert. Mit Ausnahme der Cancer-Testis-Antigen-Gene ist bisher recht wenig bekannt, welche Einzelkopie-Gene von Hypomethylierung betroffen werden. Ziel der vorgelegten Arbeit war es Gene zu identifizieren, die in invasiven Harnblasenkarzinomen durch DNA-Hypomethylierung aktiviert werden. Zu Beginn wurden aus mittels competitiver Hybridisierung von Microarrays erstellten Genexpressionsprofilen von kultivierten Tumor- und Normal-Urothelzellen eines Patienten vier Gene als Kandidaten ausgewählt. Von diesen, SNCG, S100A4,, S100A9 und LCN2, wurde mittels quantitativer RT-PCR die Expression und mittels Bisulfit-Sequenzierung die DNA-Methylierung in urothelialen Tumor-Zelllinien und -Geweben bestimmt. SNCG und S100A4 waren in einigen Tumorgeweben und –Zelllinien gegenüber normalen Kontrollen überexprimiert, aber in anderen vermindert. Dagegen waren LCN2 und S100A9 in nur wenigen Tumorzelllinien verstärkt exprimiert, jedoch in den Tumorgeweben im Durchschnitt signifikant erhöht. Der SNCG Promotor war unmethyliert in normalen und Tumor-Urothelzellen mit Expression. Fehlende Expression ging mit Hypermethylierung einher und wurde durch den DNA-Methyltransferaseinhibitor 5-Aza-2-Desoxycytidin (5aza-dC) induziert. In mesenchymalen Zellen fand sich niedrige Expression mit partieller Methylierung. Die Methylierung von regulatorischen Abschnitten im Intron und Promoter von S100A4 war in Leukozyten und Fibroblasten schwach, in urothelialen Zellen dichter und oft heterogen. Die Methylierung des LCN2 Promotors war variabel und noch weniger eng mit der Expression verbunden. Beide Gene wurden in einigen Zelllinien durch 5aza-dC induziert. Der S100A9 Promotor war in Zellen ohne Expression teilmethyliert. Zusammengenommen scheint DNA-Methylierung für die Regulation von SNCG, S100A4,, S100A9 und LCN2 bedeutsam zu sein. Speziell zeigen SNCG und S100A4 zelltyp-spezifische Methylierung. Jedoch resultieren Überexpressionen dieser Gene im Urothelkarzinom offenbar nicht primär aus DNA Hypomethylierung. Vielmehr ergaben sich starke Hinweise darauf, dass SNCG in einigen Urothelkarzinomen durch Hypermethylierung inaktiviert wird. Daher sollte bei der Interpretation von DNA-Methylierungsanalysen in menschlichen Tumoren auch an die Möglichkeit zelltypspezifischer Methylierung gedacht werden. Außerdem können Gene mit mäßigem CpG-Gehalt wie S100A4 partiell und variabel methyliert in normalen wie Tumor-Geweben vorliegen. Um weitere durch DNA-Hypomethylierung aktivierte Gene zu entdecken, wurde eine weitere, zielgerichtetere Microarray-Analyse durchgeführt. Dazu wurden mittels Affymetrix HG-U133A Microarrays Genexpressionsprofile von zwei Kulturen normaler Urothelzellen und zwei Harnblasenkarzinom-Zelllinien mit und ohne 5aza-dC verglichen. Die Filterkriterien „Induktion durch 5aza-dC“ und „verstärkte Expression in Tumorzellen“ ergaben 205 definierte Gene. Unter diesen waren solche für Chromatinfaktoren überrepräsentiert. Nach bioinformatischen Analysen auf gewebespezifische Expression und vorgesagter DNA-Methylierung, wurden 11 Gene wie oben auf Expression analysiert, nämlich DEPDC1, SIRT1, SIRT7, DDX58, LOXL2, KLF4, H2AFY, PCAF, CBX7, JMJD1A und MYST4. Die Expression vieler davon war heterogen und in einzelnen Harnblasenkarzinom-Zelllinien vermindert oder erhöht. Insgesamt waren DEPDC1, SIRT1, SIRT7, LOXL2 und H2AFY eher überexprimiert, dagegen nahm die Expression von PCAF, CBX7 und MYST4 eher ab. Bei den letzten 4 Genen zeigte sich diese Veränderung auch in Tumorgeweben. Keines der Gene scheint in einfacher Weise durch Hypomethylierung aktiviert zu werden. Zusammengefasst wurden im zweiten Teil der Dissertation eine Reihe von Genen identifizert die in Harnblasenkarzinomen eine genauere Untersuchung lohnen, besonders ihrer Proteinprodukte und in Einzelfällen auch ihrer DNA-Methylierung. Den wichtigste Befund dürfte die Identifizierung veränderter Expression mehrerer Chromatinfaktoren darstellen, die für entscheidende Chromatin-Reorganisationsschritte während der Progression von Urotheltumoren verantwortlich sein könnten. Two different changes of DNA methylation are common in human cancers. On one hand, CpG-rich sequences surrounding the transcription start sites of individual genes, which are never methylated in normal tissues, become aberrantly hypermethylated. On the other hand, sequences that are densely methylated in normal somatic tissues, such as CpG-rich satellites and interspersed retrotransposon repeat sequences, become hypomethylated. With the exception of genes encoding cancer-testis antigens, the range of single copy genes affected by hypomethylation is still poorly defined. The aim of this thesis was to identify genes activated by DNA hypomethylation in invasive bladder cancers. Four genes were selected as candidates from microarray gene expression profiles of cancerous and normal urothelial cells cultured from the same patient. Real-time RT-PCR was used to investigate expression and bisulfite sequencing to analyze methylation of SNCG, S100A4, S100A9 and LCN2 in urothelial cancer cell lines and tissues. SNCG and S100A4 were overexpressed in some cancer tissues and cell lines compared to normal controls, but downregulated in others, whereas LCN2 and S100A9 were upregulated in few cancer cell lines, but regularly in tissues. Normal and cancerous urothelial cells expressing SNCG lacked promoter methylation. SNCG downregulation was associated with hypermethylation and could be reversed by the DNA methyltransferase inhibitor 5-aza-2 -deoxycytidine (5-aza-dC). Partial SNCG methylation associated with low expression was found in mesenchymal cells. S100A4 methylation at regulatory intronic sites and in the promoter region was lowest in leukocytes and fibroblasts, denser in urothelial cells, and often heterogeneous. LCN2 promoter methylation was variable and even less consistently related to expression. 5-aza-dC increased expression of these two genes in some lines. The S100A9 promoter was partially methylated in nonexpressing cells. The data suggest that DNA methylation is involved in the regulation of SNCG, S100A4, S100A9 and LCN2. In particular, SNCG and S100A4 show cell-type specific methylation. However, any overexpression of these genes in urothelial cancer does not seem to represent primarily a consequence of DNA hypomethylation. Rather, we have obtained strong evidence that hypermethylation is involved in the downregulation of SNCG in a subset of urothelial carcinomas. Our analysis indicates that cell type-specific DNA methylation patterns should be considered when interpreting DNA methylation analyses of human cancers. Moreover, genes with moderate CpG-content, exemplified by S100A4, may often be partially and variably methylated in normal tissues and accordingly in cancers. In order to identify further candidate genes activated by DNA hypomethylation, a second microarray investigation was performed designed more specifically for this purpose. Gene expression profiles of two cultures of normal urothelial cells and two bladder cancer cell lines with or without 5-aza-dC treatment were compared using Affymetrix HG-U133A microarrays. Overall, 205 genes met the filtering criteria of being upregulated by 5-aza-dC in normal cells and overexpressed in the carcinoma cell lines. Interestingly, genes encoding chromatin proteins were overrepresented among these. Following bioinformatic analyses for tissue-specific expression and predicted methylation patterns, 11 genes were analysed for expression as above, namely DEPDC1, SIRT1, SIRT7, DDX58, LOXL2, KLF4, H2AFY, PCAF, CBX7, JMJD1A and MYST4. Overall, many of these genes had heterogeneous pattern of expression, with upregulation or downregulation in individual bladder cell lines. In general, DEPDC1, SIRT1, SIRT7, LOXL2 and H2AFY tended to be upregulated, whereas PCAF, CBX7, and MYST4 tended to be downregulated. For the latter four genes, this tendency was also confirmed in cancer compared to normal bladder tissues. None of these genes seemed to be straightforwardly activated by hypomethylation. Taken together, the second part of the thesis identified a number of genes that deserve to be investigated for their expression, especially additionally at the protein level, in bladder cancers and some also for their regulation by DNA methylation. Most importantly, the analysis identified novel expression changes in several genes encoding chromatin factors, which could be crucial for chromatin reorganisation events during the progression of bladder cancer.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	14.07.2009
Dateien geändert am:	13.07.2009
Promotionsantrag am:	01.10.2006
Datum der Promotion:	10.07.2009