Dokument: Untersuchungen zu Hitzeschockproteinen in der Hefe Hansenula polymorpha

Titel:	Untersuchungen zu Hitzeschockproteinen in der Hefe Hansenula polymorpha
Weiterer Titel:	analysis of heat-shock proteins in the yeast Hansenula polymorpha
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=12066
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100104-142947-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl. Biol. Bernsmeier, Pia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,64 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.07.2009 / geändert 08.07.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Hollenberg, Cornelis P. [Gutachter] Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Ziel dieser Arbeit war es ein Hsp70-Interaktionssystem in Hansenula polymorpha zu etablieren, bei dem Hsp70-Chaperone mit Antigenen über DnaJ-ähnliche Domänen einen Komplex bilden. Der Komplex dient der Verbesserung der Eigenschaften von Antigenen: Zum einen soll die Komplexierung mit einem Chaperon die fusionierten Zielproteine stabilisieren; zum anderen soll Hsp70 als Adjuvans die Immunantwort gegenüber dem als Antigen wirkendem Fusionsprotein verstärken. Eine Übertragung des Säuger Hsp73/T2-77-Interaktionssystem konnte durch die heterologe Expression von humanem Hsp73 in H. polymorpha erzielt werden. Dabei bildet Hsp73 mit dem Fusionsprotein über die DnaJ-ähnliche Domäne T2-77 des Tumorantigens (T-Ag) aus SV40 einen Komplex. Die zytosolischen Hsp70-Chaperone Hsp70-1 und Hsp70-2 aus H. polymorpha sind hingegen mit der T2-77-Domäne nicht kompatibel – es erfolgte keine Interaktion. Eine Anpassung des Systems an die Chaperone Hsp70-1 und Hsp70-2 wurde durch Austauschen der T2-77-Domäne gegen homologe H. polymorpha-eigene DnaJ-ähnliche Domänen der Proteine ORF12, ORF16 und ORF313 erreicht. Die ORF313-DnaJ-Domäne vermittelte die beste Assoziation mit Hsp70-Proteinen - es wurden Assoziationsverhältnisse von 1:1 erzielt. Die Mutation D→E im für andere Organismen invarianten HPD-Motiv der J-Domäne, inhibierte eine Komplexierung von ORF313-Fusionsproteinen und Hsp70 nicht. Im Gegenteil, die Mutation bewirkte eine vermehrte Assoziation mit Hsp70-Chaperonen, die auf eine Akkumulierung von Hsp70 am HPE-Fusionsprotein hindeutet. ORF12-Fusionsproteine interagierten wie Fusionsproteine ohne DnaJ-ähnliche Domäne nicht mit Hsp70-Proteinen. Die Komplexierung erfolgte ausschließlich über die homologen DnaJ-ähnlichen Domänen. Analysen von drei verschiedenen ORF313-Fusionsproteinen zeigten, dass die Interaktion von Hsp70-Proteinen über die ORF313-Domäne unabhängig vom fusionierten Zielprotein ist. Die Ablösung der Hsp70-Chaperone von ORF313-Fusionsproteinen erfolgte durch ATP nur partiell. Dies zeigte, dass die nicht-kovalente Bindung von Hsp70 und ORF313-Domäne in H. polymorpha sehr viel stärker ist, als die zwischen Säuger Hsp73 und T2-77-Domäne. Interaktionsstudien in Säugetierzellen belegen außerdem, dass die H. polymorpha DnaJ-ähnlichen Domänen der Proteine ORF12, ORF16 und ORF313 nicht mit dem Säuger Hsp73 kompatibel sind. Es konnte keine Interaktion von Hsp73 mit diesen DnaJ-ähnlichen Domänen gezeigt werden. Mit Hilfe von Protease-sensitiven Proteinen wurde untersucht, ob durch eine Komplexierung mit Hsp70 ein Schutz vor Proteolyse und somit eine Proteinstabilisierung erfolgt. Die Ergebnisse ergaben, dass eine Interaktion mit Hsp70 keine Proteinstabilisierung bewirkt. Allerdings konnte mit Hilfe dieses Systems erstmals das Hepatitis B E-Antigen (EAg) in H. polymorpha nachgewiesen werden. Die Expression scheint jedoch unabhängig von einer Interaktion mit Hsp70-Proteinen zu sein, da sowohl mit fusionierten ORF313- und T2-77-Elementen Produktbildung beobachtet werden konnte. Vielmehr scheinen die DnaJ-ähnlichen Domänen die Expression zu fördern, da EAg-Proteine ohne fusionierte DnaJ-Domäne nicht exprimiert werden konnten. Durch Immunisierungsexperimente konnte gezeigt werden, dass H. polymorpha Hsp70-1 eine adjuvantive Wirkung für komplexierte Proteine hat, die als Antigen erkannt werden. Eine Assoziation von Hsp70-1 fördert eine spezifische Antikörperbildung und, in Anwesenheit des Adjuvans AbISCO-100, eine Antigen-spezifische CD8+-T-Zellantwort. Darüber hinaus stimulierte Hsp70-1 alleine nur eine geringe Antikörperbildung und CD8+-T-Zellantwort. Hsp70-1 löst einzig eine spezifische Immunantwort gegen das im Komplex vorliegende Antigen aus. Da im H. polymorpha-System die Zielproteine individuell austauschbar sind, bietet dieses System eine interessante Perspektive für die Entwicklung verschiedener Impfstoffe gegen intrazelluläre Pathogene mit denen durch Zugabe eines einzigen Adjuvans keine ausreichende Immunantwort bzw. Schutz erzielt werden kann. The purpose of this dissertation was to establish an expression system in Hansenula polymorpha, in which chimeric antigenic proteins with a Hsp70-capturing DnaJ-like domain form stable complexes with Hsp70 in vivo. The complex-formation provides an improvement for the antigenic properties of the target protein: on the one hand being complexed with Hsp70-proteins enhances the stability of the fused target protein; on the other hand the natural adjuvant Hsp70 elicits antigen-specific immune responses when complexed with antigenic proteins. The transfer of the mammalian Hsp73/T2-77-system was accomplished by heterologous expression of human Hsp73 in H. polymorpha. Here, Hsp73 forms a complex with the fusion protein through the DnaJ-like domain T2-77 of the tumorantigen (T-Ag) of SV40. However, the cytosolic H. polymorpha Hsp70 chaperones, Hsp70-1 and Hsp70-2, were incompatible with the T2-77-domain – no interaction could be detected. The adaptation of the system to Hsp70-1 and Hsp70-2 was achieved by exchanging the T2-77-domain against homologous H. polymorpha DnaJ-like domains of the proteins ORF12, ORF16 and ORF313. The ORF313-DnaJ-domain mediated the best association with Hsp70 chaperones – an association ratio of 1:1 was obtained. The mutation D→E for the in other organisms otherwise invariant HPD-motif of the J-domain did not inhibit an interaction of the ORF313-fusion protein and Hsp70. Moreover, the mutation resulted in an even better association with Hsp70 chaperones, which indicates an accumulation of Hsp70 to the fusion proteins. ORF12-fusion proteins, like proteins without a DnaJ-like domain, did not interact with Hsp70. Complexes were formed only in the presence of DnaJ-like domains. Analysis with three different ORF313-fusion proteins demonstrated, that the interaction of Hsp70 with the ORF313-domain is independent of the fused target protein. The addition of ATP merely resulted in a partial stripping of Hsp70 from the ORF313-fusion proteins. This revealed that the non-covalent bond in H. polymorpha between Hsp70 and ORF313-domain is much stronger than the one between Hsp73 and the T2-77-domain in mammals. Interaction studies in cell cultures proved that the H. polymorpha DnaJ-like domains of the ORF12-, ORF16- and ORF313-proteins are incompatible with the mammalian Hsp73. An interaction of Hsp73 with any one of the DnaJ-like domains could not be detected. With protease-sensitive proteins we investigated if complex formation with Hsp70 causes proteolytic protection and hence better protein stability of the fusion protein. The results showed that this is not the case. Being complexed with Hsp70 did not prevent the proteolytic degradation of the fusion protein. However, for the first time the system facilitated the expression of the hepatitis E-antigen (EAg) in H. polymorpha. The Expression seems to be independent of an interaction with Hsp70: EAg-product could be detected for fusion proteins with either ORF313-elements or T2-77-elements. In fact, the DnaJ-like domains seem to assist protein expression as EAg without a DnaJ-like domain could not be expressed. Immunisation experiments showed that H. polymorpha Hsp70-1 has an adjuvant effect on complexed antigenic proteins. An Hsp70-association provokes an enhanced antigen-specific antibody production and, in the presence of a second adjuvant, AbISCO-100, an antigen-specific CD8+ T cell response. Furthermore, Hsp70-1 alone did not stimulate any significant antibody production or a CD8+ T cell response. Hsp70-1 only triggers a specific immune respone against a complexed antigen. As the target proteins are individually replaceable, the H. polymorpha system is an interesting perspective to develop vaccines for intracellular pathogens that fail to stimulate a sufficient immune response with only one adjuvant.
Rechtliche Vermerke:	Aus patentrechtl. Gründen bis 30.06.2010 zurückgestellt
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	02.07.2010
Dateien geändert am:	08.07.2009
Promotionsantrag am:	30.06.2009
Datum der Promotion:	30.06.2009