Dokument: Role of DNA-topoisomerase I in mtDNA Maintenance- Relevance of a distinct, mitochondria-targeted enzyme version in vertebrates

Titel:	Role of DNA-topoisomerase I in mtDNA Maintenance- Relevance of a distinct, mitochondria-targeted enzyme version in vertebrates
Weiterer Titel:	Die Rolle der Topoisomerase I im Metabolismus mitochondrialer DNA- Bedeutung eines eigenen, mitochondrial adressierten Enzym
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=11792
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090629-095150-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dalla Rosa, Ilaria [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 29,63 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.06.2009 / geändert 25.06.2009
Beitragende:	Univ.-Prof. Dr. Boege, Friedrich [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In vertebrate cells, mitochondrial DNA represents the only genetic material outside the nucleus. The mitochondrial genome (mtDNA) encodes an essential protein subset of the respiratory chain. Transcription and replication generate topological tensions in the circular mtDNA molecule that must be removed to enable progression of mtDNA metabolism. The only enzymes capable of releasing topological stress from double helical DNA are DNA topoisomerases. Therefore, topoisomerase activity is believed to be an essential cofactor of mtDNA metabolism. In fact, all three topoisomerase sub-families present in the vertebrate nucleus (IA, IB and IIA) are also present in mitochondria. Vertebrate evolution has split the type IB topoisomerase into two genetically distinct but catalytically similar variants: one dedicated to the nucleus (Top1) and one dedicated to the mitochondrial compartment (Top1mt). Top1mt paralogues are present in all vertebrates, but not found in invertebrates, suggesting important role(s) of this enzyme in vertebrate mtDNA metabolism. On the other hand, Top1mt was found to be dispensable for mouse development. Thus, the significance of this separately encoded enzyme remains unknown. One possible explanation would be that in long-lived vertebral species prolonged exposure to Top1 compromises mtDNA integrity and that the development of Top1mt provided a type IB enzyme version able to safely handle the mitochondrial genome. In this work, I tested this hypothesis by aberrant targeting of nuclear Top1 to mitochondria of human cells and investigating the effects of this manipulation on mtDNA metabolism. Mitochondrial targeting of YFP tagged Top1 strongly inhibited mtDNA transcription. As a consequence, the primers necessary for mtDNA replication were depleted, which ultimately led to a complete loss of mtDNA. This effect was independent of Top1 catalytic activity, since it was also induced by inactive (Y723F) mutants. In contrast, heterologous expression of YFP tagged Top1mt did not affect replication and average copy number of mtDNA. To identify which evolutionary changes in Top1mt enable safe handling of mtDNA, several regions of the two enzyme variants were inter-changed and the resulting Top1/Top1mt hybrids were then tested for their effect on mtDNA copy number. The domain swapping strategy revealed that mtDNA-destructive properties of Top1 are fully retained in all hybrids presenting residues 191-286 of the nuclear enzyme. Importantly, this region manifests its repressive effect only in the context of a functional enzyme. Finally it should be noted that expression of YFP fused Top1mt caused a slight decrease of mtDNA transcripts level, an effect not inflicted by the active site mutant (Y559F), the YFP tag alone or overexpression of the untagged enzyme. This moderate decrease of mtDNA transcripts resulted in severe mitochondrial dysfunction. In conclusion, targeting of the nuclear variant Top1 to human mitochondria is incompatible with stable mtDNA propagation and the development of Top1mt was necessary to ensure safe handling of mtDNA. Despite these evolutionary changes, Top1mt still harbours a potential to inhibit mtDNA transcription. Das einzige genetische Material außerhalb des Zellkernes in Vertebratenzellen ist das mitochondriale Genom (mtDNA), welches die Information für einen essentiellen Teil der Atmungskettenproteine enthält. Die Transkription und Replikation der zirkulären mtDNA Moleküle generieren topologischen Stress, der beseitigt werden muss, um einen korrekten Verlauf des mtDNA-Metabolismus zu erlauben. DNATopoisomerasen sind die einzigen Enzyme, die in der Lage sind, Torsionsspannungen einer DNA-Doppelhelix zu beseitigen, und die Aktivität dieser Enzyme wird daher als wesentliche Cofaktor des mtDNA-Metabolismus angesehen. Alle drei im Zellkern von Vertebraten auftretenden Unterfamilien der Topoisomerasen (IA, IB uns IIA) sind auch in den Mitochondrien vorhanden. Die Evolution von Vertebraten hat die Typ-IB Topoisomerase in zwei verschiedene Varianten aufgespalten: die eine ist zuständig für den Kern (Top1) und die andere für die Mitochondrien (Top1mt). Alle Vertebraten besitzen ein Top1mt-Paralog, Invertebraten jedoch nicht, was eine wichtige Rolle(n) von diesem Enzym im mtDNA-Metabolismus von Wirbeltieren vermuten lässt. Andererseits ist Top1mt für die Entwicklung der Maus entbehrlich, so dass die Relevanz dieses separat kodierten Enzyms bislang unklar ist. Eine mögliche Erklärung wäre, dass in lang lebenden Organismen die Integrität der mtDNA durch die Aktivität der nukleären Top1- Variante gefährdet ist, und dass deshalb im Laufe der Evolution eine Typ-IBToposomerase entstanden ist, die in der Lage ist, mtDNA sicher zu metabolisieren. Um diese Hypothese zu überprüfen, habe ich in der vorliegenden Arbeit nukleäre Top1 artifiziell in den Mitochondrien humaner Zellen exprimiert und die Auswirkungen dieser Manipulation auf den mtDNA Metabolismus untersucht. Diese mitochondriale Adressierung YFP-fusionierter Top1 führte zu einer ausgeprägten Hemmung der mtDNA-Transkription. Die daraus resultierende Verminderung von Primern, welche für die mtDNA-Replikation notwendig sind, resultierte schließlich zu einem kompletten Verlust der mtDNA. Da auch inaktive Top1-Mutanten (Y723F) denselben Effekt auslösten, ist die schädliche Wirkung der Top1 unabhängig von ihrer katalytischen Aktivität. Im Gegensatz dazu beeinflusste die heterologe Überexpression einer YFP-fusionierten Top1mt weder die Replikation noch die Kopienanzahl der mtDNA. Um herauszufinden, welche evolutionären Veränderungen der Top1mt den sicheren Umgang mit der mtDNA ermöglichen, wurden verschiedenen Regionen von Top1 und Top1mt untereinander ausgetauscht und die resultierenden Hybrid-Proteine auf ihren Einfluss auf die Kopienanzahl der mtDNA untersucht. Diese Austauschstrategie zeigte, dass die schädigenden Eigenschaften der Top1 in allen Hybriden, die die Aminosäurereste 191-286 des nukleären Enzyms beinhalten, auftreten. Diese Region zeigte ihre hemmenden Eigenschaften nur im Kontext eines funktionalen Enzyms. Hierbei ist die Tatsache bemerkenswert, dass die Expression einer YFP-fusionierten Top1mt eine leichte Abnahme der mitochondrialen Transkripte verursachte. Im Gegensatz dazu trat dieser Effekt weder bei der Expression der katalytisch inaktiven Mutante (Y723F), noch bei unfusioniertem YFP oder unfusioniertem Enzym auf. Allerdings führte diese leichte Reduktion der mtDNA Transkripte zu schweren mitochondrialen Dysfunktionen. Zusammenfassend ergibt sich ein Bild, in dem eine Adressierung der nukleären Variante Top1 in humanen Mitochondrien mit einer stabilen mtDNA Übertragung unvereinbar ist, und in dem die Entwicklung einer mitochondrialen Top1mt im Sinne eines sicheren Umgangs mit der mtDNA notwendig war. Allerdings besitzt die Top1mt trotz dieser evolutionären Anpassungen immer noch das Potential, die mtDNA Transkription zu hemmen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	29.06.2009
Dateien geändert am:	25.06.2009
Promotionsantrag am:	21.01.2009
Datum der Promotion:	05.06.2009