Dokument: Protein-Protein-Interaktion des kardialen Ankyrin-Repeat-Proteins, CARP, mit dem zytoplasmatischen ß-Aktin

Titel:	Protein-Protein-Interaktion des kardialen Ankyrin-Repeat-Proteins, CARP, mit dem zytoplasmatischen ß-Aktin
Weiterer Titel:	Protein protein interaction of the Cardiac Ankryin Repeat Protein, CARP, with the cytoplasmic ß-actin
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=11543
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090623-105228-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl.-Biotech. Naguib, Marian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,84 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.06.2009 / geändert 19.06.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Gödecke Axel [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter]
Stichwörter:	Protein-Protein-Interaktionen, TAP-Proteinaufreinigungen, Endothelzellmigration
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Assemblierung von Proteinen zu Komplexen stellt ein wesentliches Prinzip zellulärer Signaltransduktion dar. Daher stellt die Identifizierung der Proteininteraktionen einen wesentlichen Schlüssel zum Verständnis von Signaltransduktionsprozessen dar. Beflügelt wurde die systematische Analyse des Interaktoms durch die Tandemaffinitätsreinigung (TAP), die eine Isolierung von Proteinkomplexen unter nativen Bedingungen und die anschließende Identifizierung der einzelnen Komponenten mittels Massenspektrometrie (MS) erlaubt. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht das kardiale Ankyrin-Repeat-Protein, CARP, das eine Rolle bei der Mechanotransduktion im Herzen und bei der Wundheilung spielen soll. Seine genaue Funktion ist bisher allerdings unverstanden. Zur Untersuchung der unbekannten Funktion von CARP wurde die TAP/MS-Methode herangezogen, die die Aufreinigung und Identifizierung der CARP Interaktionspartner ermöglichte, um so einen Zugang zur Identifizierung der CARP-Funktion zu bekommen. Insgesamt lassen sich die Ergebnisse dieser Arbeit wie folgt zusammenfassen: 1. Ein optimiertes TAP-Tag und Reinigungsprotokoll wurde für die Aufreinigung von CARP-Proteinkomplexen aus Säugerzellen etabliert. 2. Die Aufreinigung von CARP-Proteinkomplexen aus sowohl transient als auch stabil transfizierten HEK293T-Zellen und die anschließende massen-spektrometrische Analyse führte zur Identifizierung möglicher Inter-aktionspartner von CARP, von denen drei zur Verifikation weiter analysiert wurden. 3. Die Interaktion mit - und -Tubulin erwies sich durch Kopräzipitationen und immunzytochemische Untersuchungen als falsch positiv. 4. Analyse der Interaktion mit dem zytoplasmatischen Aktin führte zur Identifizierung von β-Aktin als spezifischem Bindungspartner. Dies wurde durch immunzytochemische Analysen bestätigt. 5. CARP zeigte während der Zellteilung und in adhärierenden HEK293T-Zellen eine bevorzugte Translokation vom Kern ins Zytoplasma. 6. Auch in Endothelzellen (HUVEC) wurde CARP mit -Aktin am Aktinbogen des Lamellipodiums migrierender Zellen kolokalisiert. 7. Die CARP-Überexpression in HUVEC zeigte keinen Unterschied zu den Kon-trollzellen weder im Migrationsverhalten noch in der Angiogenese in vitro. In dieser Arbeit wird erstmalig eine Interaktion von CARP mit dem Aktin-Zytoskelett nachgewiesen. Dieser Befund eröffnet einen neuen Blick auf die Funktion von CARP, das in Endothelzellen, Podozyten, glatten Gefäßmuskelzellen etc. bisher als Bestandteil einer zellulären Stressantwort gesehen wurde. Da CARP in diesen Zellen bei Prozessen wie Hypertrophie, Wundheilung, Proteinurie, Neointima- Bildung und sogar Tumorentwicklung induziert wird, liegt es nun nahe, den Einfluss von CARP auf die Aktin-Reorganisation zu untersuchen, die bei allen diesen Prozessen eine wesentliche Rolle spielt.Die Assemblierung von Proteinen zu Komplexen stellt ein wesentliches Prinzip zellulärer Signaltransduktion dar. Daher stellt die Identifizierung der Proteininteraktionen einen wesentlichen Schlüssel zum Verständnis von Signaltransduktionsprozessen dar. Beflügelt wurde die systematische Analyse des Interaktoms durch die Tandemaffinitätsreinigung (TAP), die eine Isolierung von Proteinkomplexen unter nativen Bedingungen und die anschließende Identifizierung der einzelnen Komponenten mittels Massenspektrometrie (MS) erlaubt. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht das kardiale Ankyrin-Repeat-Protein, CARP, das eine Rolle bei der Mechanotransduktion im Herzen und bei der Wundheilung spielen soll. Seine genaue Funktion ist bisher allerdings unverstanden. Zur Untersuchung der unbekannten Funktion von CARP wurde die TAP/MS-Methode herangezogen, die die Aufreinigung und Identifizierung der CARP Interaktionspartner ermöglichte, um so einen Zugang zur Identifizierung der CARP-Funktion zu bekommen. Insgesamt lassen sich die Ergebnisse dieser Arbeit wie folgt zusammenfassen: 1. Ein optimiertes TAP-Tag und Reinigungsprotokoll wurde für die Aufreinigung von CARP-Proteinkomplexen aus Säugerzellen etabliert. 2. Die Aufreinigung von CARP-Proteinkomplexen aus sowohl transient als auch stabil transfizierten HEK293T-Zellen und die anschließende massen-spektrometrische Analyse führte zur Identifizierung möglicher Inter-aktionspartner von CARP, von denen drei zur Verifikation weiter analysiert wurden. 3. Die Interaktion mit - und -Tubulin erwies sich durch Kopräzipitationen und immunzytochemische Untersuchungen als falsch positiv. 4. Analyse der Interaktion mit dem zytoplasmatischen Aktin führte zur Identifizierung von β-Aktin als spezifischem Bindungspartner. Dies wurde durch immunzytochemische Analysen bestätigt. 5. CARP zeigte während der Zellteilung und in adhärierenden HEK293T-Zellen eine bevorzugte Translokation vom Kern ins Zytoplasma. 6. Auch in Endothelzellen (HUVEC) wurde CARP mit -Aktin am Aktinbogen des Lamellipodiums migrierender Zellen kolokalisiert. 7. Die CARP-Überexpression in HUVEC zeigte keinen Unterschied zu den Kon-trollzellen weder im Migrationsverhalten noch in der Angiogenese in vitro. In dieser Arbeit wird erstmalig eine Interaktion von CARP mit dem Aktin-Zytoskelett nachgewiesen. Dieser Befund eröffnet einen neuen Blick auf die Funktion von CARP, das in Endothelzellen, Podozyten, glatten Gefäßmuskelzellen etc. bisher als Bestandteil einer zellulären Stressantwort gesehen wurde. Da CARP in diesen Zellen bei Prozessen wie Hypertrophie, Wundheilung, Proteinurie, Neointima- Bildung und sogar Tumorentwicklung induziert wird, liegt es nun nahe, den Einfluss von CARP auf die Aktin-Reorganisation zu untersuchen, die bei allen diesen Prozessen eine wesentliche Rolle spielt. A main principle of cellular signaling pathways is the assembly of proteins in complexes. Thus, the identification of protein interactions is essential for understanding signal transduction processes. The systematic analysis of the interactome was quickened by the tandem affinity purification (TAP), which enables the isolation of protien complexes under native conditions and the subsequent identification of protein complexes via mass spectrometry (MS). This study deals with the cardiac ankyrin repeat protein, CARP, which is supposed to play a role in the mechanotransduction of the heart and in wound healing processes. Yet, its exact function is still unknown. For a better understanding of CARP’s function, this study aimed to identify its interacting partners using the TAP-MS technology. In summary, the results of this work were: 1. An optimized TAP-Tag and a TAP purification protocol were established to purifiy CARP protein complexes from mammalian cell lysates. 2. HEK293T cells that transiently as well as stably express CARP were analyzed via TAP-MS and three of the copurified proteins ( and  tubulin, β/ actin) were tested upon the validity of their interaction with CARP. 3. The interaction with  and  tubulin turned out to be false positive as shown by coprecipitation and immunocytochemical analysis. 4. The analysis of the interaction with cytoplasmic actin lead to the identification of the actin isoform as a specific binding partner of CARP. This result was confirmed by immunocytochemistry. 5. CARP showed a translocation from the nucleus to the cytoplasm during HEK293T cell division and adhesion. 6. Also in HUVEC cells CARP was colocalized with actin at the actin arch of the lamellipodiae during cell migration. 7. Overexpression of CARP showed no difference in the migratory or angiogenetic behaviour of HUVEC cells in vitro when compared to control cells. In this study a novel interaction between CARP and the actin cytoskeleton is demonstrated. This finding offers a new perspective for understanding the role of CARP which was so far referred to as a part of the cellular stress response in cardiomyocytes, endothelial cells, podocytes and smooth muscle cells. As CARP was associated with intracellular processes such as hypertrophy, wound healing, proteinuria, neointima formation or even tumor development, it is likely to further study the effect of CARP on actin reorganization, which underlies the processes mentioned above.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Bezug:	Projekt lief vom 01.04.2005 bis zum 31.04.2009 im Institut für Molekulare Kardiologie (medizinische Vorklinik)
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	23.06.2009
Dateien geändert am:	19.06.2009
Promotionsantrag am:	30.01.2009
Datum der Promotion:	29.04.2009