Dokument: Functional dissection of the Rho guanine nucleotide exchange factor Pebble in Drosophila mesoderm morphogenesis

Titel:	Functional dissection of the Rho guanine nucleotide exchange factor Pebble in Drosophila mesoderm morphogenesis
Weiterer Titel:	Untersuchungen zur Funktion des Guanin-Nukleotid-Austauschfaktors Pebble während der Mesoderm-Morphogenese in Drosophila
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=11392
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090528-135027-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	van Impel, Andreas [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,13 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 28.05.2009 / geändert 28.05.2009
Beitragende:	PD Dr. Müller, Hans-Arno Josef [Gutachter] Prof. Dr. Klein, Thomas [Gutachter]
Stichwörter:	Drosophila, Gastrulation, Mesoderm migration, Rho GEF
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The multifunctional guanine nucleotide exchange factor (GEF) Pebble (Pbl) is an essential player during cytokinesis and fibroblast growth factor-triggered mesoderm migration in the Drosophila gastrula. During cytokinesis, Pbl activates Rho1 at the cell cortex leading to the formation of the contractile actomyosin ring. Although Pbl’s role in the conserved cytokinesis pathway is well characterized, its migration-specific function is less well understood. The subcellular localization of Pbl as well as its GTPase substrate during mesoderm spreading is unknown. Furthermore, it is unclear how the switch between the dual functions of the GEF is mediated in order to guarantee a specific activation of the respective downstream pathways during cytokinesis and migration. To address these questions a domain-function analysis of the Pbl protein was conducted. This work showed that full-length Pbl localizes not only to the nucleus but also to the cell cortex and cellular protrusions in migrating cells. The PH domain and the conserved C-terminal tail are both involved in the cortical localization of Pbl. Several lines of evidence indicated that the Rac GTPase pathway is involved in mesoderm migration and that Rac is directly activated by Pbl. First, Rac genetically interacted with activated forms of Pbl in the compound eye of the fly. Lowering the dose of Rac weakened the dominant phenotype while co-expression of extra Rac led to an enhancement. Second, co-expression of wild type Rac1 enhanced the migration rescue of a constitutively active Pbl variant in a pbl loss-of-function background. Third, dominant Rac constructs were able to enhance migration defects in the hypomorphic pbl11D allele. Forth, expression of constitutive active Rac1 in the mesoderm lead, analogous to the misexpression of the constitutive active PblDH-PH, to an interference with proper mesoderm spreading. Fifth, loss of Rac1/Rac2 activity in the early embryo caused severe migration defects indicating the requirement for Rac GTPases in this process. Finally, biochemical data from a previous in vitro guanine-nucleotide-exchange-assay as well as in vitro GEF binding assays indicated that Rho1, Rac1 and Rac2 can all bind to the catalytic core of Pbl and that they are accepted as substrates. Results of gain-of-function and rescue experiments both suggested an important regulatory role for Pbl’s C-terminal tail for the selective activation of Rho1 vs. Rac dependent pathways. These data support a model in which post-translational modifications of Pbl, most likely at its conserved C-terminus, result in a change in its substrate preference. This enables at least a subpopulation of the GEF to trigger activation of Rac GTPases at the cell cortex thereby fulfilling its migration specific function. Der multifunktionelle Guaninnukleotidaustauschfaktor (GEF) Pebble (Pbl) ist eine zentrale Komponente der Zellteilungsmaschinerie. Er agiert darüberhinaus aber auch als wichtiger Faktor während der FGF-gesteuerten Zellwanderung des Mesoderms im Drosophila Embryo. Während der Cytokinese aktiviert Pbl die kleine GTPase Rho1 am Zellkortex, was die Bildung des kontraktilen Ringes zu Folge hat. Obwohl die konservierte Cytokinesefunktion des GEFs vergleichsweise gut untersucht ist, bleiben viele Fragen zum Verständnis seiner migratorischen Rolle offen. So ist nachwievor unklar, wo das Protein während der Migration in den Zellen lokalisiert und welche GTPase in diesem Kontext als Substrat für Pbl dient. Darüberhinaus konnte bislang ebenfalls nicht geklärt werden, wie das Umschalten zwischen beiden Funktionen reguliert wird, um jeweils eine spezifische Aktivierung des korrekten Signalweges unterhalb des GEFs zu gewährleisten. Zur Klärung der vorgenannten Fragen wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit eine Struktur-Funktionsanalyse des Pbl Proteins vorgenommen. Die zu diesem Zweck hergestellten Pbl-Konstrukte zeigten, dass Pbl nicht nur im Zellkern, sondern auch am Zellkortex sowie in Zellausläufern im Mesoderm lokalisiert. Diese Membranassoziierung wird hierbei durch die PH Domäne sowie den konservierten corboxyterminalen Bereich des Proteins vermittelt. Darüberhinaus konnte im Zuge dieser Arbeit eine Reihe von wichtigen Beweisen gesammelt werden, die nahelegen, dass Pbl, im Gegensatz zur Zellteilung, während der Migration durch den Rac GTPase Signalweg agiert. So wurde Rac zum einen als Interaktionspartner von Pbl bei genetischen Interaktionsstudien im Komplexauge der Fliege identifiziert. Hierbei konnte eine Reduktion der endogenen Rac Menge die durch Expression einer aktivierten Pbl Version ausgelösten Defekte suprimieren, während die Koexpression von wildtypischen Rac1 oder Rac2 den Phänotyp noch verstärkten. Zum anderen konnten diese genetischen Interaktionen auch während der Mesodermausbreitung bestätigt werden, da die Koexpression von wildtypischen Rac1 die Rettung des pbl Migrationsphänotyps durch eine konstitutiv aktive Pbl Form weiter verbessern konnte. Dagegen führte die Expression dominanter Rac-Konstrukte zu einer Verstärkung der Migrationsdefekte in einem hypomorphen pbl Hintergrund. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von konstitutiv aktivem Rac1 im Mesoderm, ähnlich wie die Expression des aktivierten PblDH-PH Konstrukts, zu Defekten während der Zellwanderung führt. Die Notwendigkeit einer kontrollierten Rac Aktivierung im Mesoderm konnte ferner durch die Untersuchung von Embryonen nachgewiesen werden, welche die Rac1/Rac2 Aktivität vollständig verloren hatten; unter diesen Bedingungen waren starke Defekte während der Mesodermausbreitung sichtbar. Schließlich bestätigten in vitro Bindungsstudien frühere Ergebnisse eines Guaninnukleotid-Austausch-Versuches und legen eine direkte physikalische Interaktion und somit eine direkte Aktivierung von Rac durch Pbl nahe. Im Zuge von Überexpressionsstudien und Rettungsexperimenten konnte desweiteren eine bisher unbekannte Rolle des C-Terminus von Pbl für die selektive Aktivierung von Rho1- bzw. Rac-abhängigen Signalwegen aufgezeigt werden. Diese Ergebnisse unterstützen das Modell, dass durch etwaige posttranslationale Modifikationen, vermutlich innerhalb des konservierten C-terminalen Bereiches, die Substratpräferenz des GEFs beeinflusst werden könnte. Auf diese Weise würden solche Modifikationen des Proteins dann zumindest einer Subpopulation von Pbl Molekülen erlauben, die Rac GTPasen am Zellkortex zu aktivieren, um die migrationsspezifische Funktion des GEFs zu erfüllen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Genetik
Dokument erstellt am:	28.05.2009
Dateien geändert am:	28.05.2009
Promotionsantrag am:	25.02.0009
Datum der Promotion:	14.05.0009