Dokument: Regulation der Expression und Aktivität vaskulärer Proteine durch Stickstoffmonoxid

Titel:	Regulation der Expression und Aktivität vaskulärer Proteine durch Stickstoffmonoxid
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=11261
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090529-122427-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Oppermann, Marc [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,20 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.05.2009 / geändert 12.05.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Kojda, Georg [Gutachter] Prof. Dr. Läer, Stephanie [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Ziel dieser Dissertationsarbeit ist es gewesen, verschiedene protektive und pathophysiologische Aspekte einer Aktivierung des Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaltransduktionsweges zu untersuchen. Zunächst wurde der Einfluss einer Erhöhung der Bioverfügbarkeit von sowohl exogenem als auch endogenem NO auf die Expression und Aktivität des endogenen NO-Rezeptors, der löslichen Guanylatzklase (sGC) bestimmt. In verschiedenen in-vitro-Experimenten konnte bereits gezeigt werden, dass NO die sGC-Expression regulieren kann, es war jedoch bislang unklar, ob ein solcher Mechanismus auch in-vivo und unter Behandlung mit organischen Nitraten auftritt. Untersucht wurden dazu Kaninchen und Mäuse, die mit verschiedenen Dosen der Nitrate ISMN und PETN behandelt wurden, sowie transgene Mäuse, die mittels des Tie2-Promotors eine endotheliale 2,8fache funktionale Überexpression der endothelialen-NO-Synthase (eNOS) aufwiesen. Die Expression der sGC wurde mittels Western-Blot und die Aktivität durch Bildung von radioaktiv markiertem cGMP bestimmt. Zusätzlich wurde die Nitrosylierung der β1-Untereinheit der sGC per Biotin-Switch-Assay untersucht. Die Funktion des NO/cGMP-Signalweges wurde in Organbadexperimenten und durch Bestimmung der Phosphorylierung von VASP (Vasodilator-stimuliertes Phosphoprotein) überprüft. Als wesentliches Ergebnis der Experimente stellte sich heraus, dass weder eine Behandlung mit hochdosierten organischen Nitraten noch eine blutdrucksenkende Überexpression der eNOS eine Veränderung in der Expression der sGC zur Folge hatte. Diese Daten widerlegen die Hypothese, dass eine Therapie mit langwirksamen NO-Donatoren einen signifikanten Einfluss auf die sGC-Expression haben. Jedoch war die sGC-Aktivität in den transgenen eNOS-überexprimierenden Mäusen vermindert und die S-Nitrosylierung der β1-Untereinheit erhöht – ein Ergebnis, das auf einen endogenen posttranslationalen Regulationsmechanismus hinweist. Die funktionellen Parameter des NO/cGMP-Signalweges wie beispielsweise die Vasorelaxation waren jedoch auch unter diesen Bedingungen nicht beeinflusst. Eine Wirkung des aktivierten NO/cGMP-Signalweges ist der antioxidative Effekt von NO, der auch in verschiedenen Studien mit organischen Nitraten gezeigt wurde. Ein wichtiger Mediator der antioxidativen Wirkung ist die extrazelluläre Superoxid-Dismutase (ecSOD), deren Expression als NO-abhängig beschrieben wurde. Die nitratbehandelten und transgenen Mäuse stellten ein gutes Modell für eine in-vivo-Erhöhung der NO-Bioverfügbarkeit dar. Die Expression und Aktivität der ecSOD wurden mittels Western-Blot und Cytochrom-C-Reduktionshemmung bestimmt und konnten sowohl durch Behandlung mit PETN als auch durch die eNOS-Überexpression erhöht werden. Diese Regulation stellt daher auch in-vivo einen Mechanismus der antioxidativen Wirkung von NO dar. Als zusätzlicher Effekt von PETN wurde eine Heraufregulation des ebenfalls antioxidativ wirksamen Enzyms Hämoxigenase-1 festgestellt. Der NO/cGMP Signalweg spielt auch in pathophysiologischen Zuständen, z.B. bei Sepsis oder der Bildung von Ödemen, eine Rolle. Da bekannt war, dass im akuten Anfall eines ACE-Hemmer-induzierten Angioödems die Konzentration von C-reaktivem Protein (CRP) erhöht ist, sollte der Einfluss von C-reaktivem Protein auf den NO/cGMP-Signalweg evaluiert werden. Dazu wurden Organbadversuche mit porvinen Koronargefäßen durchgeführt. In hohen, pathophysiologischen Konzentrationen relaxiert CRP diese Gefäße. Es konnte auch eine Abhängigkeit der CRP-induzierten Vasorelaxation vom NO/cGMP-Signalweg über eine Blockade mit Methylenblau festgestellt werden. Liegt es in hohen, pathologischen Konzentrationen vor, wirkt das CRP also durchaus als ein Aktivator dieses Signalweges. Darüber hinaus verstärkt CRP die Bradykinin-induzierte Vasorelaxation, ein Aspekt, der bei der Genese eines Bradykinininduzierten Ödems eine Rolle spielen kann. Da kommerziell erhältliches CRP Verunreinigungen aufweist, wodurch in experimentellen Studien Artefakte verursacht werden können, wurde anschließend eine Methode entwickelt, CRP im Labor selbst herzustellen. Die gentechnologische Herstellung des CRPs in E.coli war insofern erfolgreich, als dass es aus dem E.coli-Lysat aufgereinigt und eine Pentamerisierung im nativen Gel gezeigt werden konnte. Die Möglichkeit der Verwendung in zukünftigen Studien ist daher gegeben. The aim of these studies were to investigate different aspects of the nitric oxide (NO)/cGMP-pathway. Primarily, the influence of an increased bioavailability of exogenous as well as endogenous NO on the expression and activity of its receptor, the soluble guanylyl cyclase (sGC) was evaluated. In-vitro-data suggested that NO regulates sGC expression, but it is unclear whether this mechanism is active in-vivo and occurs in nitrate treatment. Rabbits and mice were treated with different doses of the organic nitrates isosorbide-mononitrate (ISMN) and pentaerythritol tetranitrate (PETN), respectively. Additionally, transgenic mice with a 2.8-fold overexpression of endothelial NO-synthase (eNOS) were used. Expression and activity of sGC was determined by western blot and formation of radioactive labelled cGMP, respectively. The S-nitrosylation of sGC-β1 subunit was investigated using biotin switch assay. In organ bath experiments as well as by evaluation of phosphorylation of VASP (vasodilator sitmulated phosphoprotein) it was possible to investigate the function of the pathway. The main result of these experiments is that neither treatment with high doses of organic nitrates nor a functional overexpression of eNOS lead to a significant change of expression of sGC. These data refute the hypothesis that therapeutic treatment with long acting NO donors has a significant impact on regulation of vascular sGC expression and activity in-vivo. Nevertheless, sGC activity was strongly decreased in eNOS overexpressing mice, while S-nitrosylation was increased. This result suggests an endogenous post-translational regulation mechanism in-vivo based on S-nitrosylation. However, the functional parameters such as vasodilation of the NO/cGMP-pathway were not affected under these conditions. One effect of the activated NO/cGMP-pathway is the antioxidative action of NO. The extracellular superoxide dismutase (ecSOD) is an important mediator of this effect, which was reported to be regulated NO-dependently. The nitrate-treated and the eNOS-overexpressing mice were used as a model of increased NO-bioavailability in-vivo. Expression and activity of ecSOD were investigated by western-blot and inhibition of cytochrome C reduction, respectively. Both were increased by PETN treatment and eNOS overexpression, suggesting this regulation to be a mechanism of the antioxidative effect of NO in-vivo. Additionally, PETN was shown to upregulate expression of heme oxygenase-1, another antioxidative enzyme. Activation of the NO/cGMP-pathway also plays a role in pathophysiological conditions such as edema. Aprevious study found that in acute ACE-inhibitor-induced angioedema concentration of C-reactive protein (CRP) is increased. This study investigated the influence of CRP on the NO/cGMP-pathway in organ bath experiments with porvine coronary vessels. In pathophysiologic concentrations CRP was shown to relax these vessels. Additionally, the dependence to the NO/cGMP-pathway of this relaxation was shown by complete inhibition with methylene blue. CRP also enhances relaxation induced by bradykinin which may play a role in bradykinin-induced angioedema. Commercially available CRP is often contaminated with sodium azide or lipopolysacchaides that may cause artefacts in experimental studies. Therefore, a method was developed to produce CRP in the laboratory. The production of CRP in E.coli was successful as was shown by purification and formation of the pentamer in native gel electrophoresis.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	29.05.2009
Dateien geändert am:	12.05.2009
Promotionsantrag am:	15.12.2008
Datum der Promotion:	27.01.2009