Dokument: Sekundärmetabolite mariner Schwämme, mit Schwerpunkt auf der chemischen Ökologie und biochemischen Charakterisierung der stressinduzierten Biotransformation von Aplysina-Alkaloiden

Titel:	Sekundärmetabolite mariner Schwämme, mit Schwerpunkt auf der chemischen Ökologie und biochemischen Charakterisierung der stressinduzierten Biotransformation von Aplysina-Alkaloiden
Weiterer Titel:	Secondary metabolites from marine sponges, with focus on the chemical ecology and biochemical characterisation of the stress-induced biotransformation of Aplysina alkaloids
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=11238
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090515-102617-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl. Biol. Putz, Annika [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,00 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.05.2009 / geändert 09.05.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Proksch, Peter [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:	Aplysina sponges, chemical ecology, biotransformation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich schwerpunktmäßig mit drei Themen, (I) der Isolierung und Strukturaufklärung von bioaktiven Substanzen aus marinen Schwämmen, (II) der Untersuchung des Einflusses von Umweltfaktoren auf die Sekundärmetabolit-Produktion in drei Schwammarten aus dem Mittelmeer, und (III) der Aufreinigung und Charakterisierung des Isoxazolin-spaltenden Enzyms in Schwämmen der Gattung Aplysina. Isolierung von Naturstoffen aus marinen Schwämmen Aufgrund ihrer sessilen Lebensweise und des Fehlens von physischen Verteidigungsmechanismen investieren Schwämme häufig in eine chemische Abwehr gegen Fraßfeinde. Aus diesem Grund ist der Stamm Porifera als reiche Quelle bioaktiver Substanzen bekannt, die potentielle Mittel oder Leitstrukturen für die Behandlung einer Bandbreite von menschlichen Krankheiten darstellen. Im Verlauf dieser Arbeit wurden 15 Substanzen aus acht Schwammarten isoliert, die aus dem Mittelmeer und dem Andamanischen Meer stammen, von denen 13 Substanzen bereits bekannte und zwei neue Naturstoffe darstellen. Bei den isolierten Stoffen handelte es sich um Alkaloide, Terpene, bromierte und phenolische Verbindungen. In in vitro Assays wurde eine ausgeprägte antimikrobielle und/oder cytotoxische Aktivität für einige dieser Substanzen festgestellt. Chemische Ökologie Mediterraner Schwämme Die Absolutgehalte und Zusammensetzung von bromierten Isoxazolinalkaloiden in Schwämmen der Gattung Aplysina aus Kroatien (Mittelmeer) wurden entlang eines Unterwasser-Steilhangs (1,8-38,5 m) untersucht. Die Absolutgehalte schwankten stark zwischen den einzelnen Proben und zeigten keine Korrelation zur Tiefe, in der die entsprechenden Proben gesammelt wurden. Im Gegensatz dazu fanden sich klare Unterschiede in der Alkaloidzusammensetzung. Schwämme, die in flachen Bereichen (1,8-11,8 m) gesammelt wurden, enthielten Aerophobin-2 und Isofistularin-3, die typischen Hauptmetabolite von A. aerophoba. Schwämme, die aus tiefen Bereichen stammten (11,8-38,5 m) zeigten jedoch ein für die Geschwisterart Aplysina cavernicola typisches Alkaloidmuster, mit Aerothionin und Aplysinamisin-1 als Hauptkomponenten. Das für A. cavernicola typische Pigment 3,4-dihydroxychinolin-2-carboxylsäure konnte in diesen Schwämmen jedoch nicht gefunden werden, stattdessen schien das A. aerophoba Pigment Uranidin in allen analysierten Proben vorhanden zu sein. In Transplantationsversuchen zeigte sich, dass sich die Alkaloidzusammensetzung auch 12 Monate nach Verpflanzung in andere Tiefen nicht verändert. In einem weiteren Experiment wurden Klone dreier verschiedener Schwammarten (Aplysina, Dysidea avara und Agelas oroides) in 5-6 m Tiefe in situ entweder in natürliche Lichtbedingungen verpflanzt oder künstlich abgedunkelt, indem photosynthetisch aktive Strahlung eliminiert wurde. Für die Aplysina Schwämme blieb die Sekundärmetabolitzusammensetzung auch bei diesem Transplantationsversuch über einen Zeitraum von 12 Monaten erstaunlich stabil. Bei D. avara und A. oroides ließ die geringe Menge an auswertbaren Proben nach 4 Monaten keine Schlüsse zu, außer daß die intensive Lichteinstrahlung in 5-6 m Tiefe offenbar tödlich für die nicht-abgedunkelten Klone war. Zusammenfassend blieb die Sekundärmetabolit-zusammensetzung der untersuchten Aplysina-Schwämme erstaunlich stabil, und änderte sich weder unter Einfluß verschiedener Tiefen noch Lichtbedingungen. Stressinduzierte Biotansformation in Aplysina Schwämmen Aktivierte Verteidigungssysteme beruhen auf Protoxinen, die nach Zerstörung der Zellkompartimentalisierung in den entsprechenden Verteidigungsstoff umgewandelt werden. Im marinen Habitat stellen Schwämme der Gattung Aplysina ein bemerkenswertes Beispiel für solch eine aktivierte Abwehr dar. Wird das Gewebe des Schwammes verletzt, werden die fraßhemmenden Isoxazolin-Alkaloide wie z.B. Aerophobin-2 enzymatisch gespalten, wobei das Nitril Aeroplysinin-1 entsteht, das weiter in ein Dienon metabolisiert werden kann. Beide Biotransformations-Produkte besitzen antimikrobielle Aktivität gegen eine Bandbreite von marinen Mikroorganismen. Da bis heute kein biochemisches Äquivalent zu einer solchen Reaktion bekannt ist, hatte diese Arbeit die Aufreinigung und Charakterisierung des Isoxazolin-spaltenden Enzyms zum Ziel. Die Aufreinigung von gefriergetrockneten, aufgeschlossenen Schwammzellen mittels differenzieller Zentrifugation, Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie lieferte enzymatisch aktive Fraktionen, die Aerophobin-2 in vitro spalteten. Spezifisches Markieren mit an Biotin gekoppeltem Substrat Aerophobin-2 und anschließender Detektion mittels Western Blot führte zur Identifizierung von fünf Proteinen mit Affinität für Aerophobin-2. Durch In-Gel Trypsinverdau und anschliessende Massenanalyse konnte eines dieser Proteine als Actin identifiziert werden. Da für die Peptidsequenzen eines weiteren Proteins keine homologen Sequenzen gefunden wurden, blieb dessen Identität unbekannt. This thesis focussed on three major topics, (I) the isolation and structure elucidation of bioactive metabolites from marine sponges, (II) investigating the influence of environmental factors on secondary metabolite production in three Mediterranean sponge species, and (III) purification and characterisation of the isoxazoline cleaving enzyme involved in the activated defence of Aplysina sponges. Isolation of natural compounds from marine sponges Since sponges are sessile organisms that usually lack physical means of protection, they commonly invest in chemical defence mechanisms against predators. The phylum Porifera is therefore a rich source of bioactive secondary metabolites, representing potential agents or lead structures for the treatment of a wide range of human diseases. During the course of this thesis, a total of 15 compounds was isolated from eight sponge species collected in the Mediterranean and Andaman Sea, among those 13 known and two new compounds. Isolated substances included alkaloids, terpenes, brominated and phenolic compounds. In vitro bioassays exhibited considerable antimicrobial and/or cytotoxic potential of several of these substances. Chemical ecology of Mediterranean sponges Total amounts and patterns of bromoisoxazoline alkaloids of Aplysina sponges from Croatia (Mediterranean Sea) were analysed along an underwater slope ranging from 1.8 to 38.5 m. Total amounts of alkaloids varied greatly from sample to sample and showed no correlation with depth. In contrast, striking differences of alkaloid patterns were found between sponges from shallow sites (1.8-11.8 m) and those collected from deeper sites (11.8-38.5 m). Sponges from shallow depths consistently exhibited alkaloid patterns typical for Aplysina aerophoba with aerophobin-2 and isofistularin-3 as main constituents. Sponges from deeper sites (below 11.8 m) resembled Aplysina cavernicola with aerothionin and aplysinamisin-1 as major compounds. The typical A. cavernicola pigment 3,4-dihydroxyquinoline-2-carboxylic acid, however, could not be detected in the latter sponges but was replaced by the A. aerophoba pigment uranidine which appeared to be present in all sponge samples analysed. In transplantation experiments, alkaloid patterns were found to be stable over a period of 12 months and unaffected by this change in depth. In a further experiment, clones of three different sponges, i.e. Aplysina, Dysidea avara and Agelas oroides were either kept in situ under natural light conditions or artificially shaded by excluding photosynthetically active radiation in shallow depths of 5-6 m. Secondary metabolite patterns remained unaffected over an observation period of 12 months for Aplysina sponges. For D. avara and A. oroides, the number of viable clones remaining after four months did not allow for conclusions other than a detrimental effect of intense light on these two species. In summary, metabolite patterns in Aplysina sponges proved to be remarkably stable and unaffected by changing light conditions or depth. Stress induced biotransformation in Aplysina sponges Activated defence systems rely on preformed protoxins which are transformed into actual defence metabolites after disturbance of cellular compartmentilisation. In the marine environment, a striking example for this can be found in sponges of the genus Aplysina. Upon tissue wounding, fish-deterring bromoisoxazoline alkaloids such as aerophobin-2 are enzymatically cleaved, giving rise to the nitrile aeroplysinin-1, which may be further metabolised into a dienone. Both biotransformation products, the nitrile and the dienone, display pronounced antibiotic activity against a range of marine microorganisms. Since no biochemical equivalent to this unusual biotransformation is known to date, this thesis aimed at the purification and characterisation of the isoxazoline cleaving enzyme. Purification of lyophilised sponge cells via differential centrifugation, ion exchange and affinity chromatography yielded enzymatically active fractions that catalysed cleavage of the isoxazoline alkaloid aerophobin-2 in vitro giving rise to aeroplysinin-1. Specific labelling with the biotin-labelled substrate aerophobin-2 and subsequent detection via Western Blot led to the identification of five protein bands with affinity for aerophobin-2 in SDS gels. In-gel trypsin digestion and subsequent mass analysis identified one of these proteins as actin. Another peptide sequence was obtained for a protein of approx. 60 kDa, for which no homologous sequences could be found. In summary, the isoxazoline cleaving enzyme proved to be an integral membrane protein which is most likely held in position by the actin cytoskeleton. It was further revealed that the isoxazoline enzyme is not a single protein, but most probably an enzyme complex.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	15.05.2009
Dateien geändert am:	09.05.2009
Promotionsantrag am:	19.03.2009
Datum der Promotion:	04.05.2009