Dokument: Etablierung eines neuen T7 RNA-Polymerase-abhängigen Expressionssystems zur koordinierten Expression aller Gene einer Genregion

Titel:	Etablierung eines neuen T7 RNA-Polymerase-abhängigen Expressionssystems zur koordinierten Expression aller Gene einer Genregion
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=10656
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090324-095840-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Markert, Annette [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,37 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.03.2009 / geändert 16.03.2009
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Mikroorganismen produzieren zahlreiche Naturstoffe, die für die Biotechnologie und Medizin von großer Bedeutung sind. Viele dieser Naturstoffe weisen eine komplexe Struktur auf und für ihre Synthese wird in der Regel eine große Anzahl von Enzymen benötigt, deren Gene häufig natürlicherweise in einer gemeinsamen Genregion vorliegen. Bislang stellt es ein beinahe unlösbares Problem dar, mehrere Gene eines solchen Klusters gemeinsam und koordiniert in einem heterologen Wirtsorganismus zu exprimieren. In den meisten Fällen setzt dabei bereits die Größe einer solchen Genregion technische Grenzen für ihre molekulargenetische Handhabung. Zusätzlich liegen die funktionell gekoppelten Gene eines Klusters meistens nicht in einer Transkriptionseinheit und Transkriptionsrichtung vor und weisen somit mehr als einen Transkriptionsterminator und mehr als einen Promotor auf. Wirtsfremde Promotoren werden jedoch in mikrobiellen Produktionsstämmen normalerweise nicht erkannt, wodurch die koordinierte Expression der Gene eines solchen Klusters nicht möglich ist. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Entwicklung des „in vivo auto cloning and expression“-Systems (IVAC). Das IVAC-Expressionssystem basiert auf zwei Kassetten, der L-IVAC- und R-IVAC-Kassette, die aus verschiedenen funktionellen Elementen zusammengesetzt sind. Beide IVAC-Kassetten enthalten je ein Antibiotikaresistenzgen, mit dem eine spezifische Selektion nach der erfolgreichen Integration neben dem zu exprimierenden Genkluster möglich wird. Zusätzlich befinden sich in den IVAC-Kassetten genetische Elemente zur konjugativen Übertragung des markierten Genklusters und der anschließenden Integration in das Wirtschromosom mittels Transposition. Um die funktionelle Expression aller Gene des Klusters unabhängig von spezifischen Promotoren und Transkriptionsterminatoren zu erreichen, ist auf jeder IVAC-Kassette je ein T7 RNA-Polymerase-abhängiger Promotor lokalisiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte anhand verschiedener Genkluster gezeigt werden, dass die virale T7 RNA-Polymerase bakterielle Transkriptionsterminatoren ignoriert und sich somit für die funktionelle Expression komplexer Genkluster eignet. Unter anderem wurde am Beispiel des Hydrogenase-Genklusters aus Rhodobacter capsulatus mittels RT-PCR und einem Hydrogenase-Aktivitätstest gezeigt, dass die T7 RNA-Polymerase ausgehend von einem entsprechenden T7-Promotor alle Gene des Klusters, unabhängig von wirtseigenen Promotoren und Transkriptionsterminatoren, exprimieren kann und somit die ideale Polymerase für die heterologe Expression komplexer Genkluster ist. Die Funktionalität des IVAC-Expressionssystems wurde daraufhin anhand des Prodigiosin-Genklusters (pig) aus Serratia marcescens überprüft. Aufgrund der fungiziden, bakteriziden und immunsuppressiven Wirkung ist Prodigiosin von besonderer biotechnologischer Relevanz. Im Gegensatz zu bislang verwendeten Expressionssystemen, die eine effiziente heterologe Synthese von Prodigiosin nicht ermöglichen konnten, wurden mit Hilfe des IVAC-Expressionssystems sowohl E. coli- als auch Pseudomonas putida-Produktionsstämme erzeugt, die Prodigiosin synthetisieren konnten. Die vollständige Expression der Gene des Prodigiosin-Genklusters sowie die Prodigiosin-Synthese wurden in den verschiedenen Bakterienstämmen mittels RT-PCR, Absorptionsmessungen und Massenspektrometrie analysiert. Die IVAC-vermittelte Synthese von Prodigiosin in den neuen Produktionsstämmen übertraf dabei die Prodigiosin-Produktion des natürlichen Produzenten S. marcescens. Mit Hilfe des neuen IVAC-Expressionssystems ist es somit erstmals möglich, (a) große Genkluster durch die Integration der IVAC-Kassetten zu markieren, (b) den markierten Abschnitt mittels Konjugation in verschiedene Gram-negative Bakterienstämme zu übertragen und (c) anschließend durch Transposition stabil in das Genom des neuen Wirtes zu integrieren. Mit der T7 RNA-Polymerase wird (d) die vollständige Expression aller Gene eines Klusters, unabhängig von ihrer Anzahl und Orientierung, gewährleistet. Microorganisms produce an immense variety of natural products with useful biological properties. The heterologous expression of natural product biosynthetic pathways is of increasing interest in biotechnology and drug discovery. This technique allows the overproduction of structurally complex substances through transfering the biosynthetic genes from the original bacterial strains to more amenable heterologous hosts. Natural products are often structurally complex substances and are encoded by a large number of genes which are organized in large gene regions. Up to now, it is an irresolvable problem to express such gene clusters in heterologous hosts, because their size limits their molecular genetic manipulation. In addition, their original promoters are often not recognized in heterologous hosts. The aim of this work was the creation of the “in vivo auto cloning and expression”-system (IVAC-system). The IVAC-system is based on two cassettes, called L-IVAC- and R-IVAC-cassette, which consist of several genetic components. Both cassettes comprise one antibiotic resistance gene as a selection marker for their integration next to the gene cluster of interest. Additionally, an origin of transfer and transposon elements are integrated in both IVAC-cassettes to enable the conjugational transfer of the gene cluster and the IVAC-cassettes into any Gram-negative host strain and their stable insertion into the host chromosome by transposition. For the expression of the target genes T7-promoters were inserted in both IVAC-cassettes. The T7 RNA-polymerase is proposed to ignore bacterial transcription terminations and to be particularly suitable for the transcription of clustered bacterial genes. To confirm this assumption the uptake hydrogenase gene cluster of Rhodobacter capsulatus was studied as an example. After site-specific integration of the T7-promoter upstream of the hydrogenase gene region, the T7 RNA-polymerase dependent overexpression of all hydrogenase genes has been proven successfully by RT-PCR and by specific enzyme activity measurements. The feasibility of the IVAC-system was verified by the heterologous expression of the prodigiosin gene cluster (pig) of S. marcescens. Prodigiosins are of increasing interest for biotechnology, because they show antifungal, antibacterial, antiprotazoal and immunosuppressive activities. Up to now, it was not possible to produce prodigiosin heterologously in E. coli. The IVAC-system enabled the transfer of the pig-cluster to the new heterologous host strains E. coli and P. putida and the IVAC-dependent expression of prodigiosin was analysed in detail and successfully by RT-PCRs, measurements of absorption spectra and mass-spectrometry. With the new IVAC-technology the heterologous production of prodigiosin in E. coli and P. putida even exceeded the prodigiosin-synthesis in the natural producer strain S. marcescens. The new IVAC expression system enables for the first time (a) the labeling of any gene cluster of interest, (b) the conjugational transfer of the gene cluster to different expression hosts, (c) the integration into the host chromosome via transposition and finally (d) the concerted T7 RNA-polymerase dependent expression of all clustered genes, independent of the orientation of the single genes, natural promoters and transcription terminations.
Rechtliche Vermerke:	Aus patentrechtlichen Gründen bis 30.09.2009 zurückgestellt, verlängert bis 31.03.2010
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	12.04.2010
Dateien geändert am:	16.03.2009
Promotionsantrag am:	01.12.2008
Datum der Promotion:	26.01.2009