Dokument: Ca2+, Mg2+ und Urat: Modulatoren des Hämocyanins der Europäischen Languste (Palinurus elephas). Charakterisierung ihrer Bindung an das Hämocyanin und ihres Effekts auf die Sauerstoffbindung des Hämocyanins

Titel:Ca2+, Mg2+ und Urat: Modulatoren des Hämocyanins der Europäischen Languste (Palinurus elephas). Charakterisierung ihrer Bindung an das Hämocyanin und ihres Effekts auf die Sauerstoffbindung des Hämocyanins
Weiterer Titel:Ca2+, Mg2+ and urate: Hemocyanin modulators of the European spiny lobster (Palinurus elephas). Characterisation of their binding to hemocyanin and their effects on hemocyanin's oxygen binding.
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URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20090225-074819-2
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Deutsch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Wänke, Astrid [Autor]
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Dateien vom 04.02.2009 / geändert 04.02.2009
Beitragende:Prof. Dr. Manfred K. Grieshaber [Gutachter]
Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:Arthropoden, Ca2+, Crustaceen, Hämocyanin, Hypoxie, isotherme Titrationskalorimetrie, Mg2+, MWC-Modell, Palinuridae, Sauerstoffbindungskurven, Three-State-MWC-Modell, Urat
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:Die Sauerstoffbindungseigenschaften des Arthropodenhämocyanins werden über komplexe allosterische Mechanismen reguliert. Bekannt ist, dass eine Vielzahl von Modulatoren die Sauerstoffaffinität des Proteins beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit wurde die Ca2+-, Mg2+-, Urat- und Koffein-Bindung an das Hämocyanin der Europäischen Languste (Palinurus elephas) mittels isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) charakterisiert. Zudem wurde ihr Einfluss auf die Sauerstoffbindungseigenschaften des Proteins über allosterische Modelle betrachtet und ihre physiologische Bedeutung herausgearbeitet. Die Sauerstoffaffintät des in seine monomeren Untereinheiten zerfallenen Hämocyanins war mit einem Halbsättigungswert von P50 = 18,65 +/- 1,96 Torr gering. Durch die Zusammenlagerung der monomeren Untereinheiten zu hexameren Aggregaten wurde die Sauerstoffaffinität des Moleküls signifikant erhöht. Die Komplexbildung ist ein endothermer Vorgang, der auch ohne die Beteiligung von Ca2+- und Mg2+-Ionen bei pH 8,0 stattfand. Die Sauerstoffbindung an das Ca2+-, Mg2+- und Na+-ionenfreie Hämocyanin erfolgte kooperativ. Jedoch wurde das Pigment erst zu einem effektiven Sauerstofftransportprotein, wenn die Ca2+- oder Mg2+-Ionen an der Hexamerbildung beteiligt waren. Die Ca2+- und Mg2+-Ionen besetzen identische Bindungsplätze am Ca2+-, Mg2+- und Na+-ionenfreien hexameren Hämocyanin von Palinurus elephas. Eine Auswertung mit dem Non-Interacting-Site-Modell ergab für das Ca2+-Ion nCa = 61 +/- 2,8 und für das Mg2+-Ion nMg = 49,8 +/- 3,0 Bindungsplätze. Die differierende Anzahl an Bindungsplätzen kann auf die unterschiedlich großen Hydrathüllen der Ionen zurückgeführt werden. Die Bindungsaffinität war mit kCa = 0,16 +/- 0,01 mM-1 für Ca2+ und kMg = 0,15 +/- 0,01 mM-1 für Mg2+ nicht signifikant unterschiedlich. Die gemeinsamen Bindungsplätze der Ca2+- und Mg2+-Ionen können zudem vom monovalenten Na+-Ion besetzt werden. Durch die Besetzung dieser Bindungsplätze wurde die Sauerstoffaffinität des Hämocyanins signifikant gesteigert und eine Strukturveränderung des hexameren Hämocyanins initiiert, die zur Bildung von nCa = 4,36 +/- 0,34 spezifischen Bindungsstellen für Ca2+-Ionen mit einer Bindungskonstanten von kCa = 2,88 +/- 0,28 mM-1 führte. Die Besetzung der spezifischen Ca2+-Bindungsstellen reduzierte die Sauerstoffaffinität des Hämocyanins und erhöhte die Sauerstoffversorgung der Gewebe um ca. 40 %. Die Sauerstoffbindungsdaten konnten mit dem Three-State-MWC-Modell am besten charakterisiert werden. Die Kombination dieser Daten mit den ITC-Daten führte zu der allosterischen Modellvorstellung, dass die Bindung der Ca2+- und Mg2+-Ionen an die gemeinsamen Bindungsplätze unter Hypoxie eine Änderung von der T- zur S- bzw. von der S- zur R-Konformation induziert, wodurch die Sauerstoffaffinität erhöht wird. Unter Normoxie führt die Bindung der Ionen zu keiner Konformationsänderung. Hingegen verursacht die Anlagerung der Ca2+-Ionen an die spezifischen Bindungsstellen unter Hypoxie und Normoxie eine entgegengesetzte Konformationsänderung - d.h. von S- zur T- bzw. R- zur S-Form - und bewirkt so eine Abnahme in der Sauerstoffaffinität des Hämocyanins. Unter Normoxie ist die Ca2+-Ionenkonzentration in der Hämolymphe nicht ausreichend, um die spezifischen Ca2+-Bindungsstellen zu besetzen. Durch eine Konzentrationserhöhung z.B. bei biotopbedingter Hypoxie könnten die Ca2+-spezifischen Bindungsstellen besetzt werden. Die Sauerstoffaffinität des Hämocyanins würde herabgesetzt und eine schnelle Sauerstoffbereitstellung für die Gewebe gewährleistet.
Als weitere Effektoren wurden Urat und sein Strukturanalogon Koffein betrachtet. Sowohl Urat als auch Koffein banden nicht an das monomere Hämocyanin von Palinurus elephas. Erst durch die Zusammenlagerung der monomeren Untereinheiten zu hexameren Aggregaten wurden Bindungstaschen ausgebildet, an die beide Modulatoren binden konnten. ITC-Verdrängungsexperimente zeigten, dass Urat und Koffein zwei identische Bindungsplätze besetzen. Die Bindung erfolgte nicht kooperativ. Die Bindung von Urat an das hexamere Hämocyanin rief eine signifikante Erhöhung in der Sauerstoffaffinität bei gleichzeitiger verminderter Kooperativität hervor. Urat band an die unter Hypoxie dominierende T-Konformation mit khypUrat = 16,13 +/- 2,90 mM-1. Hierdurch lagerte sich das Hämocyanin von der T- in die S-Konformation um und die Sauerstoffaffinität erhöhte sich (kT = 0,037 +/- 0,008 Torr-1; kS = 0,308 +/- 0,075 Torr-1). Unter Normoxie dominierte die R-Konformation. Die Uratbindung bewirkte keine Konformationsänderung. Das Hämocyanin dient der Europäischen Languste auch unter Normoxie als Sauerstofftransportprotein. So betrug die maximale Sauerstoffentladung des Hämocyanins an das Gewebe 54 % bei der unter Normoxie vorhandenen Uratgrundkonzentration und einer Temperatur von 20 °C. Die unter biotopbedingter Hypoxie erhöhte Uratkonzentration verursacht keine vermehrte Sauerstoffabgabe ans Gewebe. Die erhöhte Konzentration dient vermutlich dazu, das unter Hypoxie vermehrt vorhandene Hämocyanin mit Urat zu sättigen.

The characteristics of oxygen binding of arthropod hemocyanin are controlled by complex allosteric mechanisms. It is well-known that a multiplicity of modulators affect the oxygen affinity of the protein. In the present study, the binding of Ca2+, Mg2+, urate and caffeine to the hemocyanin of the European spiny lobster (Palinurus elephas) was characterised using isothermal titration calorimetry (ITC). Furthermore, the influence of the oxygen binding of the protein was examined using allosteric models and physiological importance was elaborated. The oxygen affinity of the hemocyanin which was separated into its monomeric subunits had a low half saturation value of P50 = 18,65 +/- 1,96 Torr. The aggregation of the monomeric subunits to hexameric molecules significantly enhanced the oxygen affinity. The aggregation is an endothermic process, which occurred without the involvement of Ca2+ and Mg2+ ions at pH 8,0. The binding of oxygen to the Ca2+, Mg2+ and Na+ ionfree hemocyanin was cooperative. However, the pigment only became an effective oxygen carrier when the ions Ca2+ or Mg2+ were involved in hexamer aggregation. The Ca2+ and Mg2+ ions occupy identical binding sites of the Ca2+, Mg2+ and Na+ free hexameric hemocyanin of Palinurus elephas. An analysis with the non-interacting site model showed for the Ca2+ ion nCa = 61 +/- 2,8 and for the Mg2+ ion nMg = 49,8 +/- 3,0 binding sites. The different number of binding sites can be attributed to differently sized hydration shells. The binding affinity of Ca2+ (kCa = 0,16 +/- 0,01 mM-1) and Mg2+ (kMg = 0,15 +/- 0,01 mM-1) showed no significant difference. Furthermore, the joint binding sites of the Ca2+ and Mg2+ can be occupied by the monovalent Na+ ion. The occupation of these binding sites significantly enhanced the oxygen affinity of the hemocyanin and a structual change of the hexameric hemocyanin was initiated, which lead to the formation of nCa = 4,36 +/- 0,34 specific binding sites for Ca2+ ions with a binding constant of kCa = 2,88 +/- 0,28 mM-1. The occupany of the specific Ca2+ binding sites reduced the oxygen affinity of the hemocyanin and increased the oxygen supply of the tissue by approximately 40 %. The oxygen binding data was characterised best by the three-state MWC model. The combination of this data with the ITC data leads to an allosteric model conception, that the binding of the Ca2+ and Mg2+ ions to their joint binding sites during hypoxia initiates a conformation change from T to S respectively from S to R, whereby the oxygen affinity is increased. During normoxia the binding of the ions leads to no change in conformation. In contrast to this, the binding of the Ca2+ ions to the specific binding sites during hypoxia and normoxia induced a contrary conformation change -i.e. from S to T respectively from R to S- and caused a decrease in the oxygen affinity of hemocyanin. Under normoxia the Ca2+ concentration in the hemolymph is not high enough to occupy all the specific Ca2+ binding sites. Through an increase of the concentration, for example during environmental hypoxia, the Ca2+ specific binding sites could all be saturated. The oxygen affinity of the hemocyanin would be decreased and a fast oxygen provision for the tissue would be warranted. As further effectors urate and its structural analogue caffeine were examined. Both urate and caffeine did not bind to the monomeric hemocyanin of Palinurus elephas. It was not until the monomeric subunits aggregated to hexameres that a binding pocket was developed, on to which both modulators were able to bind. ITC-displacement tests showed that urate and caffeine occupy two identical binding sites. The binding was not cooperative. The binding of urate to the hexameric hemocyanin caused a significant increase in oxygen affinity and at the same time a decrease in cooperativity. Urate bound to the during hypoxia dominating T conformation with khypUrate = 16,13 +/- 2,90 mM-1. Through this, the hemocyanin transferred from the T to the S conformation and the oxygen affinity increased (kT = 0,037 +/- 0,008 Torr-1; kS = 0,308 +/- 0,075 Torr-1). During normoxia the R conformation dominated. The binding of urate caused no conformation change. The hemocyanin also serves the European spiny lobster during normoxia as an oxygen carrier. At a basic urate concentration typical for normoxia and a temperature of 20 °C the maximum oxygen released by hemocyanin into the tissue was 54 %. The increased urate concentration during environmental hypoxia caused no increased oxygen release into the tissue. The increased concentration during hypoxia is probably used to saturate the abundantly available hemocyanin with urate.
Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Zoophysiologie
Dokument erstellt am:25.02.2009
Dateien geändert am:04.02.2009
Promotionsantrag am:11.11.2008
Datum der Promotion:23.01.2009
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