Dokument: Untersuchungen zum molekularen Mechanismus der Induktion der Cyclooxygenase-2-Expression durch UVB-Strahlung in HaCaT-Keratinozyten

Titel:	Untersuchungen zum molekularen Mechanismus der Induktion der Cyclooxygenase-2-Expression durch UVB-Strahlung in HaCaT-Keratinozyten
Weiterer Titel:	Investigations concerning the molecular mechanism of the induction of cyclooxygenase-2 expression by UVB radiation in HaCaT keratinocytes
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=10240
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090128-095740-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Fernau, Niklas S. [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 13,81 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.01.2009 / geändert 27.01.2009
Beitragende:	Dr. Klotz, Lars-Oliver [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Stichwörter:	Cyclooxygenase-2, UVB, HuR, EGF-Rezeptor
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Cyclooxygenase-2 (COX-2) ist ein induzierbares, im Entzündungsgeschehen zentrales Enzym, dessen gesteigerte Bildung nach UV-Exposition in der menschlichen Haut mit Photokarzinogenese in Verbindung gebracht wird. In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Mechanismus der Induktion der COX-2-Bildung durch UVB-Strahlung (280-320 nm) an kultivierten menschlichen Keratinozyten (HaCaT) untersucht. Die COX-2-Induktion durch UVB wurde auf mRNA-, Protein- und Produktebene (Nachweis von Prostaglandin E2) gezeigt. Parallel induziert UVB eine starke und lang anhaltende Aktivierung der Stresskinase p38MAPK, deren Aktivität sich als für die COX-2-Induktion erforderlich erwies, was sowohl auf Protein- als auch auf Produktebene gezeigt wurde. Als weitere die COX-2-Induktion modulierende Faktoren wurden Proteinkinase C-Aktivität sowie der nukleozytoplasmatische Transportkomplex CRM1 identifiziert. Die maßgebliche Rolle des RNA-Bindeproteins und posttranskriptionellen Modulators HuR bei der COX-2-Induktion durch UVB wurde anhand der Depletion mittels siRNA auf mRNA- und Protein- sowie Produktebene herausgearbeitet. UVB induziert zudem die Translokation von HuR aus dem Zellkern ins Zytoplasma. Die Beteiligung eines weiteren RNA-Bindeproteins, hnRNP A0, an der Induktion der COX-2 konnte ausgeschlossen werden. Behandlung mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und UVB-Bestrahlung (100 J/m2) führen in HaCaT-Zellen zu einer COX-2-Induktion vergleichbaren Ausmaßes. Obgleich UVB-Induktion durch Hemmung des EGF-Rezeptors sowie durch Tyrosinkinasehemmung vermindert wird, weisen mehrere Ergebnisse darauf hin, dass UVB und EGF – entgegen bisheriger Annahmen – unterschiedliche Signalkaskaden stimulieren: (i) Weder in Western-Blot-Analysen noch immuncytochemisch konnte eine der EGF-Wirkung entsprechende Tyrosinphosphorylierung oder Internalisierung des Rezeptors durch UVB gefunden werden, und (ii) weder Hemmung der p38MAPK noch Depletion von HuR beeinflussten die EGF-induzierte COX-2-Expression. Am Beispiel der durch UVA-Strahlung (320-400 nm) induzierten Tyrosinphosphorylierung des EGFR sowie der nachfolgenden Signalkaskade in HeLa-Zellen wurde bestätigt, dass eine UV-induzierte Stimulation des EGFR dennoch prinzipiell möglich ist, jedoch definierte Bestrahlungsbedingungen erfordert. Mit dem Ah-Rezeptor wurde ein zweites zelluläres Rezeptorsystem, dessen Bedeutung für die zelluläre Wirkung von UVB bekannt ist, hinsichtlich seiner Bedeutung für die UVB-induzierte COX-2-Expression untersucht. In Ah-Rezeptor-defizienten HaCaT-Zellen wurde zwar in der Tat eine abgeschwächte UVB-Induktion der COX-2 festgestellt, jedoch wurde umgekehrt eine verglichen mit UVB nur sehr geringe Induzierbarkeit der COX-2 durch AhR-Liganden in HaCaT gefunden. Insgesamt spricht dies für eine lediglich modulierende, nicht aber entscheidende Rolle des Ah-Rezeptors im untersuchten System. Die genaue Kenntnis der molekularen Prozesse, die eine Induktion der COX-2 durch UVB vermitteln, ist Voraussetzung für eine auf Hautkrebsprävention gerichtete pharmakologische Intervention. In der vorliegenden Arbeit wurden einerseits mit der Stresskinase p38MAPK, dem RNA-Bindeprotein HuR sowie Proteinkinase C potentielle Zielstrukturen einer solchen Intervention identifiziert – andererseits wurde die Bedeutung von bisher als entscheidend für diese Induktion angenommene Faktoren, EGF- und Ah-Rezeptor, relativiert. The enzyme cyclooxygenase-2 (COX-2) is a crucial regulator of inflammatory processes, the expression of which is found to be enhanced in human skin exposed to ultraviolet radiation and is linked to UV-induced carcinogenesis. This work focuses on molecular mechanisms contributing to the induction of COX-2 expression by UVB radiation (280-320 nm) in cultured human keratinocytes (HaCaT). Induction of COX-2 expression upon exposure to UVB was demonstrated to occur at the level of mRNA, protein and product (detection of prostaglandin E2). In parallel, UVB caused a strong and persistent activation of the stress kinase p38MAPK, whose activity was then demonstrated to be required for UVB-induced COX-2 expression and PGE2 formation. Moreover, protein kinase C activity and the nucleocytoplasmatic transport complex CRM1 were identified as further factors modulating COX-2 induction. The RNA binding protein and posttranscriptional modulator, HuR, was then demonstrated by means of siRNA-based depletion experiments to be a major regulator of UVB-induced COX-2 expression, taking both mRNA or protein and PGE2 as parameters. In line with a role of HuR in UVB-induced effects, UVB was found to stimulate translocation of HuR from nucleus to cytoplasm. In contrast, another RNA binding protein, hnRNP A0, was found not to be involved in COX-2 induction by UVB. Induction of COX-2 expression is elicited to similar extents in HaCaT cells exposed to epidermal growth factor (EGF) or to UVB (100 J/m2). Although UVB-induced COX-2 expression is attenuated by inhibition of the EGF receptor or employing an unspecific tyrosine kinase inhibitor, arguing for a UVB effect via the EGF receptor, several data in this work support the novel view that different signaling cascades are stimulated by UVB and EGF: (i) no significant tyrosine phosphorylation or internalization of the EGF receptor that are caused by EGF was found in Western Blot analyses or immunocytochemically in cells exposed to UVB, and (ii) neither inhibition of p38MAPK nor depletion of HuR affected EGF-induced COX-2 expression. UVA (320-400 nm)-induced EGF receptor tyrosine phosphorylation and stimulation of downstream events in HeLa cells was used to demonstrate that UV-induced EGF receptor stimulation is possible provided that irradiation conditions are strictly defined. A second cellular receptor described in the literature as a major cellular target of UVB, the arylhydrocarbon receptor (AhR), was then analyzed with respect to its contributions to UVB-induced COX-2 expression. In line with previous reports, an attenuated induction of COX-2 by UVB was observed in AhR-deficient HaCaT cells. Conversely, however, induction of COX-2 in HaCaT cells by well-known efficient AhR ligands was minor compared to induction elicited by UVB, implying that the AhR may modulate, but is unlikely to be essential for induction of COX-2 expression by UVB. Pharmacological intervention aiming at the prevention of COX-2-dependent skin carcinogenesis requires exact knowledge of the molecular processes causing induction of COX-2 by UV radiation. The present work both identifies novel potential targets for such an intervention (the stress kinase p38MAPK, the RNA binding protein HuR and protein kinase C) and challenges the view that EGF and Ah receptors are major regulators of COX-2 expression following exposure to UVB.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » An-Institute » Institut für Umweltmedizinische Forschung (IUF) an der HHU
Dokument erstellt am:	28.01.2009
Dateien geändert am:	27.01.2009
Promotionsantrag am:	01.12.2008
Datum der Promotion:	20.01.2009