Dokument: On the mechanisms of non-photochemical quenching in plants and diatoms

Titel:	On the mechanisms of non-photochemical quenching in plants and diatoms
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=10227
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090128-135820-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. rer. nat. Miloslavina, Yuliya [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,41 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 26.01.2009 / geändert 26.01.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Holzwarth, Alfred R. [Gutachter] Prof. Dr. Kleinermanns, Karl [Gutachter]
Stichwörter:	Arabidopsis, time-resolved fluorescence, photosynthesis, non-photochemical quenching, ultrafast spectroscopy, diatom algae, photosystem II, BBYs
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Photosynthetic organisms possess a highly efficient photo-protective apparatus respon-sible for non-photochemical quenching (NPQ) of the excess excitation energy that helps them to minimize the harmful effects of excess light. The rapidly-reversible part of NPQ, termed qE, is associated with a number of different factors: the pH gradient across the thylakoid membrane, the action of the PsbS protein, the xanthophyll cycle conversion, i.e. de-epoxidation of violaxanthin into zeaxanthin (Zx), conformational changes in the light-harvesting complexes of PS II (LHC II). The exact mechanism of qE is however not known, the quenching sites, their location and molecular origin remain questionable. These questions are addressed in the thesis by time-resolved fluorescence spectroscopy performed on different levels of organization and physiological state of the photosyn-thetic apparatus – from isolated pigment-protein complexes to intact leaves. The single photon counting technique was utilized for registering fluorescence emission with pico-seconds time resolution and exceptionally high dynamic range and signal-to-noise ratio, allowing a detailed multicomponent analysis of the fluorescence kinetics. For the first time intact plant leaves and diatom cells (Bacillariophyceae) were measured in-vivo in NPQ state in physiological conditions. The successful analysis and interpretation of the extremely complex fluorescence decay kinetics of the intact system was made possible by combining the knowledge acquired in previous studies, reviewed in the introductory part of the thesis, together with the preliminary investigations in this work, performed on isolated PS II cores, PS II enriched thylakoid membranes, and isolated LHC II in dif-ferent aggregation states. The gathered experimental data were thoroughly treated by applying a kinetic modeling (target analysis) approach in order to gain insight into the biophysical parameters (en-ergy and electron pathways, transfer and decay rate constants, species spectra that re-veal the molecular nature of the fluorescence-emitting components). Different kinetic models suitable for each particular experimental system were designed and applied to fit the data. In addition, in some instances theoretical modeling was applied, which re-veals the contributions of the various intermediates to specific apparent lifetimes and al-lows to estimate the time dependence of the populations of the inter¬mediates. Considerable similarities in the early electron transfer rates of PS II reaction centres (RCs, without antenna), cyanobacterial PS II cores (with core antenna), and a higher plant PS II enriched membranes (with core and peripheral antenna) were found. The energy transfer rates scale with increase in the antenna size. Thus the dynamics of the initial photochemical steps of PS II could be implemented in the model describing the in-vivo fluorescence as well. Fluorescence time-resolved kinetics was measured in vivo from leaves of Arabidopsis in unquenched dark-adapted states with open and closed RCs (F0 and Fmax, respectively) and compared to the kinetics measured under quenched light-adapted condition (FNPQ). The data were fit using a kinetic compartment model combining the previously investi-gated energy and electron transfer dynamics in PS II and PS I. The results of the kinetic modeling revealed two principal changes in the fluorescence kinetics, signifying the gen-eration of NPQ: 1) appearance of a new far-red-enhanced fluorescence component func-tionally disconnected from either PS I or PS II and that was shown to originate from peripheral LHC II detached from PS II; 2) increase of the non-photochemical deactiva-tion rate (kD) that is a direct measure of NPQ in the PS II-attached antenna. Thus, NPQ was found to consist of two separate mechanisms and sites of action, termed quenching site 1 and 2 (Q1 and Q2), respectively. These two quenching sites were further investi-gated by analyzing the fluorescence kinetics in different Arabidopsis mutants lacking dif-ferent components of the photosynthetic apparatus and also by comparison with isolated LHC II in vitro. The spectral features of the fluorescence of disconnected LHC II were reminiscent of the fluorescence of LHC II oligomers in vitro, therefore it was proposed that the Q1 site of quenching represents detached and oligomerized LHC II. Thus the NPQ-associated addi-tional fluorescence component serves as a spectroscopic marker for the formation of LHC II oligomers in vivo. It is characterized by a spectrally broad and a strongly far-red enhanced fluorescence spectrum. The far-red emitting state is proposed to be an emis-sive Chl-Chl charge transfer state. The Q1 site of quenching was missing in the Arabidop-sis mutant npq4 lacking PsbS protein but was enhanced in the PsbS overexpressing mutant (L17), therefore it was concluded that the role of PsbS in NPQ is to mediate the detachment and oligomerization of LHC II. The increase of the kD constant was not observed in the Arabidopsis mutant npq1 lacking Zx but was present in both npq4 and L17. Therefore the Q2 site is strictly dependent on Zx availability and does not depend on the action of PsbS. A study of minor antenna knock-out mutants – koCP24, koCP26 and koCP24/koCP26 revealed further details of the Q2 mechanism – CP24 is the most crucial minor antenna complex for the Q2 quench-ing, whereas CP26 does not take part in it. In conclusion of the results obtained from the time-resolved fluorescence analysis of in-tact leaves, a new model of the qE mechanism in higher plants was developed. It de-scribes the location and molecular origin of the two quenching sites that work independently and complement each other. The research work on NPQ was extended to cover diatoms that represent a major part of the phytoplankton. We aimed to find differences in the NPQ mechanism in diatoms since they have a different structure of the thylakoid membrane, and completely different an-tenna compared to higher plants. Surprisingly, despite of the differences, the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Cyclotella meneghiniana operated the same qE mecha-nism with the same two quenching sites. As a result of the analysis of the diatom fluores-cence kinetics under quenched and unquenched conditions, a model for the NPQ in diatoms was presented. According to this model there are two subpopulations of the light-harvesting antenna (fucoxanthin-chlorophyll-binding protein, FCP). The Q1 site of quenching is located in FCP subpopulation II which is detached from PS II and oligomer-ized under high light intensities. The Q2 site takes place in FCP subpopulation I, which is attached to PS II. Regardless of what type of antenna the photosynthetic organisms pos-sess, they seem to utilize the same NPQ mechanisms which turn out to have universal character. Photosynthetische Organismen verfügen über eine hocheffiziente Einheit, die für die nicht-photochemische Löschung ("Non-Photochemical Quenching", NPQ) der über-schüssigen Anregungsenergie verantwortlich ist und dazu dient, die schädlichen Wir-kungen der überschüssigen Lichtenergie zu minimieren. Der hochreversible Teil des NPQ, das sogenannte „qE-Löschen“, wird mit unterschiedlichen Faktoren in Verbindung gebracht: Der pH-Gradient über der Thylakoidmembran, die Funktion des PsbS Proteins, die Konversion des Xanthophylls, d.h. die Deepoxidierung von Violaxanthin zu Zea-xanthin (Zx) und die Konformationsänderungen in den Lichtsammelkomplexen (LHC II) des Photoystems II (PS II). Der genaue Mechanismus des qE-Löschens ist jedoch nicht bekannt und sowohl die Lokalisierung als auch der molekulare Ursprung werden kon-trovers diskutiert. Diesen Fragestellungen wird in der vorliegenden Arbeit mittels zeitaufgelöster Fluores-zenzspektroskopie nachgegangen, wobei als photosynthetische Systeme sowohl isolierte Pigment-Protein-Komplexe als auch intakte Pflanzenblätter betrachtet wurden. Hierzu wurde die Single-Photon-Timing-Methode verwendet, welche die Messung von Fluores-zenzemissionen in Pikosekunden-Zeitbereich mit einer außergewöhnlich hohen Dyna-mik sowie einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis erlaubt und dadurch eine detaillierte Multikomponentenanalyse der Fluoreszenzkinetiken ermöglicht. Zum ersten Mal wur-den intakte Pflanzenblätter und Diatomeenen (Bacillariophyceae) unter physiologischen Bedingungen in-vivo im NPQ-Zustand gemessen. Die Analyse und Interpretation der hochkomplexen Fluoreszenzkinetiken intakter Systeme wurde ermöglicht durch die Kombination von Erkenntnissen früherer Arbeiten (vgl. Einleitung) mit den im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen an isolierten PS II Kern-Komplexen, an mit PS II angereicherten Thylakoidmembranen und an isolierten LHC II in verschiede-nen Aggregationszuständen. Die Auswertung der experimentellen Daten erfolgte unter Verwendung von Kinetik-Modellierungsansätzen („Target Analysis") mit dem Ziel, biophysikalische Parameter wie beispielsweise die Energie- und Elektronentransferwege, Transfer- und Zerfallge-schwindigkeitskonstanten sowie Spektren, welche die molekulare Natur der fluoreszie-renden Komponenten wiedergeben, zu erhalten. Unterschiedliche Kinetikmodelle wurden entsprechend des dem jeweiligen Experiment zugrunde liegenden Systems entwickelt und zur numerischen Anpassung an die Daten angewendet. Zusätzlich wur-den in einigen Fällen theoretische Modellierungen durchgeführt, um die einzelnen Bei-träge verschiedener Intermediate zu spezifischen Lebensdauern zu erhalten und um ei-ne Abschätzung der zeitabhängigen Populationen der einzelnen Intermediate zu ermög-lichen. Bemerkenswerte Ähnlichkeiten der Elektronentransferraten in PS II Reaktionszentren ("RCs", ohne Antenne), in PS II Kern-Komplexen von Cyanobakterien (mit Kernantenne) und in Membranen, die mit dem PS II höherer Pflanzen angereichert waren (mit Kern- und peripherer Antenne), wurden festgestellt. Die Energietransferraten skalieren mit der Zunahme der Antennengrösse. Die Dynamiken der ersten photochemischen Schrit-te im PS II konnten in das Modell implementiert werden, wodurch auch die Beschrei-bung der in-vivo-Fluoreszenz möglich wurde. Es wurden die zeitaufgelösten Fluoreszenzkinetiken von Arabidopsis-Blättern in vivo im nicht-gelöschten, dunkel-adaptierten Zustand sowohl mit offenen als auch geschlosse-nen Reaktionszentren (F0 bzw. Fmax) gemessen und mit den unter gelöschten licht-adaptierten Bedingungen gemessenen Kinetiken (FNPQ) verglichen. Die Daten wurden unter der Verwendung von Kompartment-Kinetikmodellen, welche die zuvor untersuch-ten Energie- und Elektronentransferdynamiken in isolierten PS II und PS I kombinieren, gefittet. Die Ergebnisse der Kinetikmodellierungen zeigen hauptsächlich zwei Verände-rungen in den Fluoreszenzkinetiken, welche die Bildung von NPQ aufzeigen: 1) Auftre-ten einer neuen fernrot-verstärkten Komponente, die funktionell sowohl vom PS I als auch vom PS II abgekoppelt ist und wie gezeigt wurde im peripheren Lichtsammelkom-plex LHCII, das vom PS II abgekoppelt ist, entsteht; 2) Anstieg der NPQ-Deaktivierungsrate (kD), die ein direktes Maß für das NPQ in den angekoppelten Anten-nen darstellt. Daher erfolgt das NPQ mit zwei verschiedenen Mechanismen an zwei ver-schiedenen Orten der Löschung, die Löschung 1 bzw. Löschung 2 (Q1 und Q2) genannt werden. Diese zwei Orte der Löschung wurden weiter untersucht sowohl durch die Ana-lyse der Fluoreszenzkinetiken verschiedener Arabidopsis-Mutanten, bei denen verschie-dene Komponenten der photosynthetischen Einheit fehlten, als auch durch Vergleich mit isolierten LHCII in vitro. Die spektralen Merkmale der Fluoreszenz von abgekoppelten LHC II ähnelten den Merkmalen der in vitro Fluoreszenz von LHC II Oligomeren. Aus diesem Grund wurde vorgeschlagen, dass die Löschung 1 durch den abgekoppelten und oligomerisierten LHC II dargestellt wird. Folglich dient die zusätzliche, mit dem NPQ verknüpfte Fluoreszenz-komponente als spektroskopischer Marker für die Bildung von LHC II Oligomeren in vi-vo. Charakteristisch hierfür ist ein spektral breites, im Fernrot verstärktes Fluoreszenzspektrum. Es wird angenommen, dass dieser im fernroten Bereich emittie-render Zustand ein Chl-Chl-Ladungstransferzustand ist. Die Löschung 1 wurde in der Arabidopsis Mutante npq4, das kein PsbS besitzt, nicht beobachtet, trat jedoch verstärkt in der Mutante mit überexprimierten PsbS Protein (L17) auf. Aus diesem Grund wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass die Funktion des PsbS im NPQ-Zustand die Abkopp-lung und Oligomerisierung von LHCII unterstützt. Die Zunahme der kD Konstante wurde in der Arabidopsis Mutante npq1, das kein Zx auf-weist, nicht beobachtet, jedoch sowohl in npq4 als auch in L17. Folglich ist die Löschung 2 vom Vorhandensein des Zx abhängig, jedoch nicht von der Funktion des PsbS. Die Un-tersuchung von Minoren-Knock-out-Mutanten - koCP24, koCP26 sowie koCP24/koCP26 zeigten weitere Details des Q2-Mechanismus: CP24 ist der entscheidende Minoren-Antennenkomplex für die Q2-Löschung, während CP26 nicht daran beteiligt ist. Den Ergebnissen der Analyse der zeitaufgelösten Fluoreszenz intakter Blätter zufolge wurde ein neues Modell für den qE-Mechanismus höherer Pflanzen entwickelt. Dieses Modell beschreibt sowohl die Lokalisierung als auch den molekularen Ursprung der zwei Orte der Löschung, welche unabhängig voneinander und komplementär zueinan-der arbeiten. Die Forschungsarbeit an NPQ wurde auf Diatomeenen, die einen Hauptbestandteil des Phytoplanktons darstellen, ausgedehnt. Hierbei bestand die Zielsetzung darin, Unter-schiede im NPQ Mechanismus in Diatomeenen zu finden, da diese eine unterschiedliche Struktur der Thylakoidmembran und im Vergleich zu höheren Pflanzen eine völlig ande-re Antenne aufweisen. Überraschenderweise folgen die Diatomeenen Phaeodactylum tricornutum und Cyclotella meneghiniana trotz der bestehenden Unterschiede demsel-ben qE-Mechanismus mit gleichen Orten der Löschung. Der Analyse der Fluoreszenzki-netiken von Diatomeenen unter licht- sowie dunkel-adaptierten Bedingungen folgend wurde ein NPQ-Modell für Diatomeenen vorgelegt. In diesem Modell gibt es zwei Sub-populationen der lichtsammelnden Antenne (Fucoxanthin-Chlorophyll bindendes Prote-in, FCP). Der Q1-Löschungsort befindet sich in der FCP Subpopulation II, die vom PS II abgekoppelt ist und unter hohen Lichtintensitäten oligomerisiert wird. Der Q2-Löschungsort befindet sich in der FCP Subpopulation I, die an das PS II angegliedert ist. Unabhängig davon, welchen Antennentyp die photosynthetischen Organismen aufwei-sen, scheinen diese denselben NPQ-Mechanismus zu folgen, welcher einen universellen Charakter aufzeigt.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Bezug:	1.06.2005-28.11.2008
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	28.01.2009
Dateien geändert am:	26.01.2009
Promotionsantrag am:	09.10.2008
Datum der Promotion:	28.11.2008