Dokument: Hydroxynitril-Lyasen für die Biotechnologie
| Titel: | Hydroxynitril-Lyasen für die Biotechnologie | |||||||
| Weiterer Titel: | Hydroxynitrile-lyases for biotechnology | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=10215 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20090126-101932-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Guterl, Jan-Karl [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | PD Dr. Pohl, Martina [Betreuer/Doktorvater] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Hydroxynitril-Lyase, Enzymstabilität, Enzymoptimierung | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Bei den Hydroxynitril-Lyasen (HNLs, EC 4.1.2.X) handelt es sich um eine strukturell heterogene Gruppe von Enzymen, die in der Natur die Spaltung von Cyanhydrinen katalysieren, aber auch zur Herstellung enantiomerenreiner Cyanhydrine eingesetzt werden.
In dieser Arbeit wurden die drei HNLs aus Manihot esculenta (MeHNL), Arabidopsis thaliana (AtHNL) und Linum usitatissimum (LuHNL) im Hinblick auf einige biotechnologisch relevante Aspekte charakterisiert, wie z.B. die Pufferverträglichkeit, die pH- und temperaturabhängige Aktivität und Stabilität oder, wie im Fall der LuHNL, auch das Substratspektrum. Bei der Untersuchung der Pufferverträglichkeit zeigten AtHNL und LuHNL in allen getesteten Puffern gute Aktivitäten, wohingegen die MeHNL durch Acetat stark inhibiert wird. Obwohl sowohl MeHNL als auch AtHNL zur strukturellen Familie der alpha/beta-Hydrolasen gehören und beide über die gleichen katalytisch aktiven Aminosäuren verfügen, trägt ein veränderter Substratbindungsmechanismus der AtHNL, der mit einem veränderten Aufbau des aktiven Zent-rums einhergeht, dazu bei, dass diese nicht durch Acetat inhibiert wird. Da bei der technischen Anwendung der HNLs aufgrund der besseren Stabilität der Produkte im Sauren sowie zur Unterdrückung der basenkatalysierten, nicht-enantioselektiven Addition von HCN an die Carbonylkomponenten normalerweise niedrige pH-Werte vorherrschen, lag ein Schwerpunkt dieser Arbeit auf der Charakterisierung der pH-abhängigen Aktivität und Stabilität dieser Enzyme. Es wurde gezeigt, dass die MeHNL von den drei untersuchten En-zymen im sauren pH-Bereich sowohl die höchste Aktivität als auch Stabilität aufweist. Aktivität und Stabilität der LuHNL liegen im Vergleich zur MeHNL etwas niedriger, während die AtHNL bereits bei schwach sauren pH-Werten sehr schnell inaktiviert und in diesem Bereich dementsprechend auch wenig Aktivität aufweist. Für zwei Enzyme konnten Möglichkeiten zur Stabilisierung gefunden werden: während die Verwendung der MeHNL in E. coli-Zellrohextrakten zu einer drastischen Zunahme der Stabilität führt, kann die AtHNL durch Zusatz kompatibler Additive wie Saccharose oder Sorbitol stabilisiert werden. Zusätzlich wurden die pH-abhängigen Inaktivierungsmechanismen der MeHNL und der AtHNL durch den Einsatz verschiedener spektroskopischer Methoden detailliert untersucht. Es zeigte sich, dass die MeHNL auf ein Absenken des pH-Wertes mit einer schnellen, partiel-len Entfaltung alpha-helikaler Strukturbereiche reagiert, was mit einem zeitlichen Abstand von zwei Stunden zu einer Aggregation des Enzyms führt. Bei der AtHNL hingegen führt das Ab-senken des pH-Wertes zu einem kontinuierlich verlaufenden Verlust an Sekundärstruktur, der an einen schnell verlaufenden Aggregationsprozess gekoppelt ist. Da die LuHNL im Hinblick auf ihr Substratspektrum vor allem auf aliphatische Aldehyde und Ketone beschränkt ist, wurde in der vorliegenden Arbeit versucht, durch gerichtete Evolution und rationales Design das Substratspektrum des Enzyms zu erweitern. Im Falle der gerichteten Evolution konnte aufgrund der Redundanz des genetischen Codes keine Erweiterung des Substratspektrums erzielt werden. Bei einer durch rationales Design entwickelten Variante verursachten die eingefügten Mutationen eine komplette Inaktivierung des Enzyms, was mög-licherweise auf eine veränderte Bindung des katalytisch aktiven Zink-Ions zurückgeführt wer-den kann.Hydroxynitrile Lyases (HNLs) are a structural heterologous group of enzymes which are nowadays applied in technical processes to catalyze the formation of chiral cyanohydrins. In this work the HNLs from Manihot esculenta, Arabidopsis thaliana and Linum usitatissimum were thoroughly characterized with respect to several biotechnological relevant aspects, such as buffer tolerance, ph- and temperature dependent activity and stability and the substrate spectrum. All three HNLs were examined with respect to their activity in different buffers. AtHNL and LuHNL showed good activity in all tested buffer systems, whereas the MeHNL was strongly inhibited by acetate. Although MeHNL and AtHNL, both belonging to the superfamily of alpha/beta-hydrolases, are structurally related, differences in their active site architecture and in their catalytic mechanisms were found to cause these differences in buffer tolerance. Since HNLs usually have to cope with pH-values in the acidic range in technical applications being due to the improved product stability at low pH-values, special emphasis was laid on the pH-dependent activity and stability of the three enzymes. Additionally, in the cases of the (S)-selective MeHNL and its (R)-selective counterpart from Arabidopsis thaliana, the denaturation processes occurring upon exposure to acidic pH-values were analyzed in a detailed way, using a variety of spectroscopic methods and uncovering two different inactivation pathways. Upon a pH-shift the MeHNL reacts by a fast, but incomplete loss of secondary structure which is followed by an aggregation of the enzyme with a time delay of 2 h. The AtHNL, which is far less stable in the acidic range, shows a continuous loss of secondary structure which is coupled to a quick proceeding aggregation process. In both cases possibilities to increase the enzymes’ pH-dependent stability could be found. For the MeHNL the use of crude E. coli cell extracts improved the pH-stability drastically, whereas the AtHNL could be stabilized by using compatible solutes like saccharose or sorbitol. The LuHNL, which shows a similar pH-stability as the MeHNL, shows a narrow substrate range which is primarily focussed on aliphatic aldehydes and ketones. In order to overcome this limitation two different approaches, directed evolution and rational design, were used. In both cases the LuHNL’s substrate range could not be broadened. For the directed evolution approach, this was due to the redundancy of the genetic code, whereas mutations predicted by rational design caused a complete inactivation of the enzyme, probably being the result of a change in the binding pattern of the catalytically active zinc ion. | |||||||
| Rechtliche Vermerke: | Aus patentrechtlichen Gründen für 6 Monate zurückgestellt | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 03.08.2009 | |||||||
| Dateien geändert am: | 23.01.2009 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 15.10.2008 | |||||||
| Datum der Promotion: | 28.11.2008 |
