Dokument: Regulation der Auswahl alternativer Spleißstellen
| Titel: | Regulation der Auswahl alternativer Spleißstellen | |||||||
| Weiterer Titel: | Regulation of alternative splice site selection | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=10192 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20090122-112415-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Singh, Kusum Kumari [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Schulze-Osthoff, Klaus [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Mehlhorn, Heinz [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Beim alternativen Spleißen werden die Introns auf verschiedene Art und Weise aus der Vorläufer-RNS herausgespleißt, wodurch aus einem Gen zahlreiche unterschiedliche Boten-RNS-Moleküle und Proteine produziert werden können. Der Vorgang des alternativen Spleißens erfordert eine akkurate Auswahl von Spleißstellen, welche eine Schlüsselrolle bei der Generierung der verschiedenen Transkripte spielen. Verschiedene regulatorische Proteinkomplexe sind aktiv an der Auswahl der Spleißstellen beteiligt, unter Anderem “kleine nukleäre” Ribonukleoproteinkomplexe mit U1, U2, U4/U6 and U5 Untereinheiten. Mitglieder der Serin/Arginin-reichen Proteine (SR-Proteine) sowie SR-verwandte Proteine (SR-rps) können ebenfalls in den Spleißstellen-Selektionsprozess eingreifen. Zusätzlich können weitere regulatorisch tätige Proteine in den Prozess des alternativen Spleißens involviert sein. In diesem Zusammenhang wurde nun die Rolle der Untereinheiten des Apoptose- und spleißassoziierten Protein (ASAP) Komplexes während der Auswahl von Spleißstellen untersucht.
Um den Einfluss dieses trimeren Komplexes auf die Spleißstellen-Selektion zu verstehen, wurde ein Reporterkonstrukt, welches auf dem HI-Virus basiert, eingesetzt. Die vorgestellten Daten zeigen, dass RNPS1 und, überraschenderweise, SAP18 starken Exon-Einschluss vermitteln können, während ein Volllänge-Acinus-S’-Konstrukt nur eine sehr begrenzte spleißregulatorische Aktivität aufweist. Mutationsanalysen zeigten auf, dass die Ubiquitin-ähnliche Struktur von SAP18 für effizienten Exon-Einschluss sowie die Lokalisierung von SAP18 in Kern-„speckles“ benötigt wird. Mit Hilfe von RNPS1-Deletionsmutanten wurde nachgewiesen, dass die Serin-reiche Domäne von RNPS1 hauptsächlich für den RNPS1-vermittelten Exon-Einschluss verantwortlich ist. Ebenfalls wiesen individuelle RS- und RS-ähnliche Domänen von Acinus und RNPS1 die Fähigkeit auf, die Auswahl alternativer Spleißstellen zu beeinflussen. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die Proteinuntereinheiten des ASAP Komplexes in der Lage sind internen Exon-Einschluss auf dem HIV-basierenden Reporterkonstrukt zu vermitteln. Dennoch sind weitere Untersuchungen notwendig, um die exakten molekularen Mechanismen zu verstehen, welche in die Spleißstellen-Selektion durch diese Proteine involviert sind. In einem zweiten Abschnitt wurden die Isoformen des zellulären FLICE-inhibitorischen Proteins (c-FLIP) untersucht. c-FLIP kann die Todesrezeptor-vermittelte Apoptose modifizieren und spielt eine wichtige Rolle während der T- und B-Zellhomöostase. Das c-FLIP-Gen wird dem Prozess des alternativen Spleißens unterworfen und drei verschiedene c-FLIP-Isoformen (c-FLIPL, c-FLIPS und c-FLIPR) konnten bis jetzt auf Proteinebene demonstriert werden. Eine analyse des c-FLIP-Gens offenbarte einen „single nucleotide“ Polymorphismus (SNP) an der 3’-Spleißstelle des Introns 6. Dieser SNP verursacht entweder eine intakte (AG) oder defekte (AA) Spleißkonsensussequenz. Während eine intakte Spleißstelle über den Einschluss Exon 7 ausschließlich Expression von c-FLIPS bewirkt, verursacht die defekte Variante die Produktion von c-FLIPR, da bei der Abschrift der RNS in das Intron 6 hineingelesen wird. Ein Vergleich der Proteinsequenzen der kleinen c-FLIP-Isoformen in verschiedenen Säugern identifierte c-FLIPR als die ursprüngliche kleine Version von c-FLIP. Mit Hilfe von in vivo und in vitro Expressionsstudien konnte beobachtet werden, dass c-FLIPS im Vergleich zu c-FLIPR erheblich stärker exprimiert wird. Weiterhin wurde mit Hilfe von RT-PCR Studien und gekoppelten in vitro Transkriptions-/Translationsexperimenten herausgefunden, das die höhere Expression von c-FLIPS auf der Ebene der Proteintranslation erreicht wird. Eine Analyse diverser humaner Zelllinien deutete auf eine gesteigerte Häufigkeit der Expression von c-FLIPR in kanzerogenen B-Zelllinien hin. Interessanterweise offenbarte die Untersuchung von follikulären Lymphompatienten eine Assoziation der rs10190751 A Variante des SNP, welche eine Zerstörung des Spleißstellenkonsensus und die Expression von c-FLIPR bewirkt, mit einem erhöhten Risiko für follikulare Lymphome. Zusammengefasst zeigen die beschriebenen Daten, dass die Expression von c-FLIPR durch einen SNP am 3’-Spleißkonsensus des Intron 6 bewirkt wird, und dass die c-FLIPR-Produktion mit einem Risiko für follikuläre Lymphome assoziiert ist.The process of transferring information from DNA to protein has become more interesting with the discovery of alternative splicing. During alternative splicing introns are spliced out in various ways from the precursor RNA, resulting in one gene producing several different mRNAs and protein products. The process of alternative splicing requires accurate selection of splice sites, which play a key factor in the generation of different transcripts. Several regulatory protein complexes take active part to aid in the selection of splice sites, like small nuclear ribonucleoprotein complexes containing U1, U2, U4/U6 and U5 subunits. The serine/arginine-rich protein family members (SR proteins) and SR-related proteins (SR-rps) also have the capability to assist in the splice site selection process. In addition, various other regulatory protein complexes might be involved in the alternative splicing process. In this regard, the role of the subunits existing in the apoptosis and splicing associated protein (ASAP) complex during splice site selection was analyzed. An HIV-based reporter construct was utilized to understand the effects of this trimeric complex on the splice site selection. The presented data show that the full-length Acinus-S’ isoform displayed only limited splicing regulatory activity, whereas both RNPS1 and surprisingly, SAP18 mediated strong exon inclusion. Mutational analysis revealed that the ubiquitin-like fold of SAP18 was required for efficient exon inclusion and for the localization of SAP18 in the nuclear speckles. The deletion mutants of RNPS1 demonstrated that the serine-rich domain is mainly responsible for the exon inclusion. The individual arginine/serine (RS)-like domains of Acinus and RNPS1 also showed the ability to modulate the selection of alternative splice acceptor sites. Taken together, the data demonstrate that the proteins of the ASAP complex are able to mediate internal exon inclusion of the HIV-based construct. However, further investigations are necessary to understand the exact molecular mechanisms involved in the specific selection of splice sites by these fusion proteins. During the study, the role of splice site in the generation of different cellular-FLICE inhibitory protein (c-FLIP) isoforms was also investigated. c-FLIP is a modulator of death receptor mediated apoptosis and plays a major role in T and B cell homeostasis. The c-FLIP gene transcript is subject to alternative splicing and so far three different c-FLIP isoforms (c-FLIPL, c-FLIPS and c-FLIPR) have been demonstrated on the protein level. Investigation of the c-FLIP gene revealed the presence of a single nucleotide polymorphism (SNP) at the 3’ splice site of the intron 6. The SNP leads to either an intact (AG) splice site or a dead (AA) splice consensus. Whereas an intact splice site directs exclusively production of c-FLIPS via inclusion of exon 7, the splice dead variant causes production of c-FLIPR due to read through into intron 6. Comparison of c-FLIP short isoform protein sequences in several mammals identifies c-FLIPR as the ancestral short version of c-FLIP. Employing in vivo and in vitro expression studies, it was observed that the c-FLIPS isoform was expressed strongly compared to c-FLIPR. With the help of RT-PCR studies and coupled in vitro transcription/translation assays, it was found that the higher expression of c-FLIPS is achieved on the protein level. Analysis of diverse human cell lines points to an increased frequency of c-FLIPR in cancerogenous B cell lines. Importantly, analysis of follicular lymphoma patients reveals an increased risk associated with the rs10190751 A genotype causing disruption of the splice consensus and expression of c-FLIPR. Collectively, the described data show that c-FLIPR is generated due to the presence of a SNP at the splice site and that c-FLIPR production is associated with an increased risk of follicular lymphoma. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Molekulare Medizin | |||||||
| Dokument erstellt am: | 22.01.2009 | |||||||
| Dateien geändert am: | 21.01.2009 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 03.12.2008 | |||||||
| Datum der Promotion: | 20.01.2009 |
