Dokument: Plastizität und Dynamik von zentralen Synapsen in neuronal differenzierten ES-Zellen der Maus un kortikalen Neuronen

Titel:	Plastizität und Dynamik von zentralen Synapsen in neuronal differenzierten ES-Zellen der Maus un kortikalen Neuronen
Weiterer Titel:	Plasticity and dynamics of central synapses in mouse ES cell-derived neurons and cortical neurons
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=10165
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090203-142241-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Stan, Adriana [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,61 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.01.2009 / geändert 23.01.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Gottmann, Kurt [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Rose, Christine R. [Betreuer/Doktorvater]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Bildung und die funktionelle Ausreifung von neuronalen Synapsen sind hochkomplexe Prozesse, die die korrekte Verschaltung und Funktionsweise neuronaler Netzwerke im Verlauf der Entwicklung des Gehirns sicherstellen. Die Akkumulation von Neurotransmitter-haltigen Vesikeln an präsynaptischen Freisetzungsstellen ist dabei ein entscheidender Schritt in der Bildung und frühen funktionellen Reifung zentraler glutamaterger Synapsen. Die Regulation der Vesikelakkumulation an aktiven Zonen erfolgt vermutlich durch transsynaptische Signalleitung über Zelladhäsionsmoleküle. Allerdings sind die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen noch unvollständig bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle des Zelladhäsionsmoleküls N-Cadherin in der Synapsenbildung und –ausreifung untersucht. Die selektive Deletion des N-Cadheringens in Mäusen führt um den 10. Tag der Schwangerschaft, noch bevor das Gehirn ausgebildet ist, zu einer früh embryonalen Lethalität. Um dieses Problem zu umgehen, wurden Ncadherin defiziente Neurone in vitro aus gentechnisch veränderten embryonalen Stammzellen (ES Zellen) der Maus, die kein intaktes N-Cadheringen mehr besitzen („knockout“), differenziert. Diese neuronal differenzierten ES Zellen wurden in einem glialen „Insel“kultursystem, das die Ausbildung eines hohen Anteils von Autapsen ermöglicht, kultiviert. Dies konnte durch Darstellung der prä- und postsynaptischen Spezialisierungen bestätigt werden. Mit Hilfe von „live-cell imaging“ an gerade entstehenden Synapsen konnte weiter gezeigt werden, dass die Rekrutierung Fluoreszenzmarkierter synaptischer Vesikel (durch Expression von DsRed2-VAMP2) in der Abwesenheit von N-Cadherin stark gestört ist. Dies führte in unreifen Neuronen zusätzlich zu einer verringerten Dichte präsynaptischer Vesikelcluster. Die Dichte der aktiven Zonen, die mittels EGFP-Bassoon dargestellt wurden, war jedoch in N-Cadherin defizienten Neuronen nicht verändert. Dies deutet darauf hin, dass N-Cadherin spezifisch an der Rekrutierung von Vesikeln an die Präsynapsen beteiligt ist. Um die Vesikelakkumulation quantitativ zu untersuchen, wurden „fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)“ Experimente durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Rekrutierung von synaptischen Vesikeln an einzelne Präsynapsen in N-Cadherin defizienten Neuronen deutlich langsamer erfolgt als in Kontrollneuronen. Darüber hinaus ergaben Zeitrafferstudien, dass die allgemeine Mobilität der synaptischen Vesikelcluster in Abwesenheit von N-Cadherin erhöht ist. Dies könnte zu einer Destabilisierung von Synapsen führen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass N-Cadherin eine wichtige Rolle bei der Ausbildung und Stabilisierung des Vesikelpools an entstehenden Synapsen zukommt. An weiter ausgereiften Synapsen scheint N-Cadherin eine weniger wichtige Rolle zu spielen, da in solchen Synapsen die präsynaptischen Spezialisierungen (Dichte der präsynaptischen Vesikelcluster und aktiven Zonen) morphologisch relativ zu Kontrollneuronen nicht unterschiedlich waren. In späteren Reifungsstadien war die Akkumulation synaptischer Vesikel weitgehend abgeschlossen und nicht mehr von Ncadherin abhängig. Dies deutet darauf hin, dass andere Zelladhäsionsmoleküle den Verlust von N-Cadherin kompensieren können. Um die molekularen Mechanismen, die der Regulation der Akkumulation synaptischer Vesikel an entstehenden Synapsen durch N-Cadherin zugrundeliegen, zu untersuchen, wurde Synapsenneubildung in unreifen Neuronen durch Expression von Neuroligin1 induziert. Neuroligin1 ist ein postsynaptisches Membranprotein, das die de novo Akkumulation präsynaptischer Vesikel nach Überexpression in Neuronen auslösen kann. Interessanterweise war der Vesikelcluster induzierende Effekt von Neuroligin1 in der Abwesenheit von N-Cadherin blockiert. Zusätzlich zeigte sich, dass N-Cadherin die Akkumulation und synaptische Lokalisation von Neuroligin1 beeinflusst. Diese Ergebnisse legten eine kooperative Interaktion zwischen zwei Zelladhäsionssystemen, dem N-Cadherin/β-catenin und dem Neuroligin/Neurexin System, in der transsynaptischen Regulation der Vesikelakkumulation nahe. Um den molekularen Mechanismus dieser funktionellen Kooperation näher zu untersuchen, wurde analysiert, ob das postsynaptische „Gerüstprotein“ S-SCAM als Verbindungsprotein („linker“) fungiert. S-SCAM ist ein Protein, das mehrere PDZ Domänen enthält und an Neuroligin1 über seine erste PDZ Domäne und weiter an β-catenin über seine 5. PDZ Domäne bindet. Um zu überprüfen, ob S-SCAM einen molekularen „linker“ zwischen dem N-Cadherin/β-catenin und dem Neuroligin/Neurexin System darstellt, wurden mutierte S-SCAM Konstrukte, die entweder eine Deletion der 1. oder der 5. PDZ Domäne aufwiesen, in cortikalen Neuronen exprimiert und es wurde der Effekt einer Neuroligin1 Überexpression analysiert. Die Expression mutierter S-SCAM Proteine führte zu einer Inhibition der funktionellen Interaktion zwischen N-Cadherin und Neuroligin1, was sich in einer Blockade der Induktion von präsynaptischen Vesikelclustern durch Neuroligin1 äusserte. Ebenso war die Akkumulation von Neuroligin1 und seine synaptische Lokalisation reduziert, was dafür spricht, dass S-SCAM eine molekulare Verbindung zwischen den beiden Adhäsionssystemen ermöglicht. Zusammenfassend konnten in der vorliegenden Arbeit erste Evidenzen für einen noch unbeschriebenen Mechanismus der Kopplung von bidirektionalen synaptischen Reifungsprozesssen, die durch Neuroligine/Neurexine vermittelt sind, und Zellerkennungsprozessen, die durch klassische Cadherine vermittelt sind, erbracht werden. During brain development, formation and functional maturation of synapses between neurons are highly coordinated processes that ensure the correct wiring and functioning of neuronal networks. The accumulation of neurotransmitter-filled vesicles at presynaptic release sites is a decisive step in the formation and early functional maturation of central glutamatergic synapses. Trans-synaptic signaling through cell adhesion molecules has been proposed to regulate vesicle clustering at active zones, however, the underlying molecular mechanisms are incompletely understood. In this study, the role of the cell adhesion molecule N-cadherin in synapse formation and maturation was addressed. Specific deletion of the N-cadherin gene in mice leads to early embryonic lethality around day 10 of gestation before the brain forms. To circumvent this problem, N-cadherin deficient neurons were obtained by in vitro differentiation from mouse embryonic stem (ES) cells genetically null for N-cadherin. ES cell-derived neurons were grown in a glial microisland culture system, in which the fraction of autapses is very high as confirmed by labeling pre- and postsynaptic specializations of glutamatergic synapses. Using a live imaging approach, it was shown that the recruitment of fluorescently labeled (by expression of DsRed2-VAMP2) presynaptic vesicles at nascent synapses is strongly impaired in the absence of N-cadherin. This in addition led to a lower density of presynatic vesicle clusters in immature neurons. However, the density of active zones, as visualized by EGFP-Bassoon, was not affected in N-cadherin deficient neurons indicating that N-cadherin is specifically involved in the recruitment of vesicles to synaptic sites. To study vesicle accumulation in a more quantitative manner, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) was used, demonstrating that the recruitment of synaptic vesicles at individual synaptic sites is much slower in immature N-cadherin deficient neurons as compared to controls. Furthermore, time lapse studies indicated that the general dynamics of synaptic vesicle clusters is increased in the absence of N-cadherin, which might destabilize synapses. Together, these findings demonstrate that N-cadherin plays an important role in the formation and stabilization of vesicle pools at nascent synaptic sites. At more mature synapses, the role of N-cadherin became less significant, as at a morphological level presynaptic specializations (density of presynaptic vesicles clusters and active zones) in N-cadherin deficient neurons were similar to control neurons. At this later maturational stage, accumulation of synaptic vesicles at synapses has largely ceased and appears to be no more an N-cadherin dependent process, indicating that other cell adhesion molecules may compensate for the loss of N-cadherin. To study the molecular mechanisms that N-cadherin uses for regulating the accumulation of synaptic vesicles at nascent synaptic sites, synapse formation was induced in immature neurons by expression of neuroligin1. Neuroligin1 is a postsynaptic transmembrane protein well known for its ability to trigger de novo accumulation of presynaptic vesicles when overexpressed in neurons. Intriguingly, neuroligin’s vesicle cluster-inducing effect was blocked in the absence of N-cadherin. In addition, N-cadherin was found to influence clustering and proper synaptic localization of neuroligin1. These studies suggested that there is a cooperative interaction between two cell adhesion systems: the N-cadherin/β-catenin and the neuroligin/neurexin system in trans-synaptically regulating the accumulation of vesicles. To gain further insight into the molecular mechanism underlying this functional cooperation, the postsynaptic scaffolding protein S-SCAM was chosen as a candidate linker protein. Previously, it was shown that S-SCAM, a multi-PDZ domain containing protein, can bind to neuroligin1 via its 1st PDZ domain and to β-catenin via its 5th PDZ domain. To test if S-SCAM could provide the molecular link between the N-cadherin/β-catenin and the neuroligin/neurexin adhesion systems, mutant S-SCAM constructs with either the PDZ1 domain or the PDZ5 domain deleted were expressed in cortical neurons and neuroligin’s function was assessed. As expected, upon overexpression of mutated S-SCAMs the functional interaction between N-cadherin and neuroligin1 was impaired and the formation of presynaptic vesicle clusters under neuroligin1 overexpression was blocked. Similarly, clustering of neuroligin1 and its synaptic localization were impaired, indicating that S-SCAM provides a molecular link between the two cell adhesion systems. In summary, the present study provides first evidence for a novel mechanism for coupling bidirectional synapse maturation mediated by neuroligins/neurexins to cell type recognition processes mediated by classical cadherins.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Neuro- und Sinnesphysiologie
Dokument erstellt am:	02.02.2009
Dateien geändert am:	23.01.2009
Promotionsantrag am:	16.10.2008
Datum der Promotion:	10.12.2008