Dokument: Oxidative Modulation zellulärer Signalwege: Einfluss redox-sensitiver Transkriptionsfaktoren auf die Sensitivierung von Krebszellen gegenüber Doxorubicin und TNF-alpha

Titel:	Oxidative Modulation zellulärer Signalwege: Einfluss redox-sensitiver Transkriptionsfaktoren auf die Sensitivierung von Krebszellen gegenüber Doxorubicin und TNF-alpha
Weiterer Titel:	Oxidative modulation of intracellular signaling: Role of redox-sensitive transcriptionfactors in sensitizing cancer cells against Doxorubicin and TNF-alpha
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=10118
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090122-110856-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Lüpertz, Regine [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,47 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.01.2009 / geändert 13.01.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Kahl, Regine [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Wunderlich, Frank [Gutachter]
Stichwörter:	oxidativer Stress, TNF, Doxorubicin, Katalase
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Für die Aufrechterhaltung von Regulationsprozessen in Zellen ist eine physiologische Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies von zentraler Bedeutung. Insbesondere H2O2 dient aufgrund seiner Membranpermeabilität als wichtiger second messenger für die Regulation von Signaltransduktionswegen und redox-sensitiven Transkriptionsfaktoren. Das intrazelluläre Niveau an H2O2 wird unter anderem über das antioxidative Enzym Katalase moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung des intrazellulären Redox-Status für die Aktivität redox-sensitiver Transkriptionsfaktoren und Signalwege bei der Sensibilisierung von Krebszellen untersucht. Die H2O2 Menge wurde in MCF-7 Mamma Karzinomzellen und Hct-116 Kolon-Karzinomzellen mithilfe zweier pro-oxidativer Substanzen (TNF-α und Doxorubicin) und transienter Überexpression des antioxidativen Enzyms Katalase moduliert. Es wurde gezeigt, dass in MCF-7 Zellen die Zytotoxizität von TNF-α entscheidend von der intrazellulären Menge an H2O2 abhängt. So führte eine Überexpression der Katalase in MCF-7kat Zellen zu einer signifikanten Verstärkung der TNF-α vermittelten Zytotoxizität und Apoptose. Gleichzeitig konnte der redox-sensitive Transkriptionsfaktor NF-κB in den MCF-7kat Zellen nur kurz transient aktiviert werden. Durch eine Bolusgabe von H2O2 wurde die NF-κB Aktivierung verlängert. Dies zeigt, dass die unzureichende Dauer der NF-κB Aktivierung durch das Fehlen des second messengers H2O2 verursacht wurde. Die zentrale Rolle von H2O2 bei der Zytotoxizität von TNF-α wurde durch die Ergebnisse an MCF-7wt Zellen zusätzlich verdeutlicht. Dort führte die Behandlung mit TNF-α zu einer lang anhaltenden, konstanten Aktivierung von NF-κB, die mit einer Reduktion der Katalase Expression und gleichzeitiger Induktion der MnSOD Expression einherging. Die differenzielle Regulation dieser beiden antioxidativen Enzyme resultierte in einer gesteigerten intrazellulären H2O2 Konzentration und somit in einer ausreichenden Aktivierung der protektiven NF-κB Signalkaskade. Ein weiterer durch H2O2 regulierter redox-sensitiver Transkriptionsfaktor ist FOXO3a, ein Mitglied der FOXO Superfamilie. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Überexpression der Katalase und somit die Verringerung der intrazellulären H2O2 Menge zu einem nukleären Export von FOXO3a führte. Der enge Zusammenhang zwischen Katalase Expression und FOXO3a Aktivität wurde dadurch unterstrichen, dass es nach Überexpression von FOXO3a zu einer Erhöhung der Katalase Expression in den MCF-7 Zellen kam. Die TNF-α vermittelte Repression der Katalase und die damit verbundene gesteigerte H2O2 Konzentration in den MCF-7wt Zellen ging mit einem nukleären Export von FOXO3a einher. In den MCF-7kat Zellen mit verminderter intrazellulärer H2O2 Konzentration kam es dagegen zu einem nukleären Import von FOXO3a. Eine Überexpression von konstitutiv aktivem FOXO3a führte zu einer Erhöhung der TNF-α Zytotoxizität in den MCF-7 Zellen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Regulation von FOXO3a in Abhängigkeit von der intrazellulären H2O2 Konzentration erfolgt und, dass FOXO3a über die Regulation der Katalase selbst Einfluss auf den Redox-Status der MCF-7 Zellen nimmt. Da im ersten Teil dieser Arbeit gezeigt wurde, dass für die Aktivierung von NF-κB eine ausreichende Menge an intrazellulärem H2O2 benötigt wird, könnte über den hier skizzierten Weg die erhöhte TNF α Zytotoxizität in den FOXO3a überexprimierenden MCF-7 Zellen erklärt werden. Das Zytostatikum Doxorubicin wird häufig in der Therapie von soliden Tumoren verwendet und kann unter anderem als intrazellulärer Redox-Zykler zu einer Akkumulation von ROS in den Zellen führen. Aus diesem Grund wurde die Rolle von H2O2 bei der Doxorubicin vermittelten Zytotoxizität und Regulation redox-sensitiver Transkriptionsfaktoren in Hct-116 Kolon-Karzinomzellen untersucht. Doxorubicin führte zu einer Akkumulation von ROS und zu einer Repression der Katalase Expression. Im Gegensatz zur TNF-α Schädigung führte der beschleunigte Abbau von intrazellulärem H2O2 durch die Überexpression der Katalase jedoch nicht zu einer signifikanten Veränderung der Zytotoxizität von Doxorubicin. Eine Kurzzeit Inkubation (3 h) bedingte einen p53 und p21 abhängigen G2/M Arrest und daraus folgend eine dosisabhängige Apoptose, die vermutlich c-Myc abhängig reguliert wurde. Eine Inkubation für 24 h dagegen resultierte in einem Stopp der Transkription und Translation und einem Arrest der Zellen vor dem Eintritt in die G2/M-Phase. FOXO4, ein weiteres redox sensitives Mitglied der FOXO Superfamilie, das Zellzyklus Arrest und Apoptose reguliert, kann durch eine JNK abhängige Phosphorylierung aktiviert werden. In Hct-116 Zellen hatte die JNK Aktivierung jedoch keinen Effekt auf die FOXO4 Aktivität und die Doxorubicin vermittelte Zytotoxizität. Dagegen konnte der PI3K/AKT/FOXO4 Signalweg mit der Doxorubicin Zytotoxizität verknüpft werden. So wurde gezeigt, dass die AKT Kinase in den Hct-116 Zellen Doxorubicin abhängig aktiviert wird und dies zu einer Phosphorylierung und einem nukleären Export von FOXO4. In der vorliegenden Arbeit konnte auf diesen Ergebnissen aufbauend eine Sensibilisierung der Hct-116 Zellen gegenüber Doxorubicin erzielt werden. Eine Überexpression von FOXO4 selbst oder einer dominant-negativen AKT erhöhte die Doxorubicin vermittelte Zytotoxizität und Apoptose. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass eine Hemmung des PI3K/AKT Signalweges oder die Aktivierung des redox-sensitiven Transkriptionsfaktors FOXO4 als Ansatzpunkte für die Sensibilisierung von Krebszellen gegenüber Zytostatika betrachtet werden können. Physiological amounts of intracellular reactive oxygen species (ROS) are of great importance to maintain proper functions of redox-signaling processess. Particularly H2O2, due to its membrane permeating properties, serves as a second messenger for regulation of signaling transduction pathways and redox-sensitive transcription factors. Maintenance of intracellular redox homeostasis is in part mediated by enzymatic antioxidant systems. In particular intracellular levels of H2O2 can be reduced by the antioxidant enzyme catalase the major H2O2-scavenging enzyme in the cells. In the present study the impact of cellular redox state on regulation of redox-sensitive signaling pathways was investigated with regard to sensitizing cancer cell. Modulation of intracellular redox state in MCF-7 breast carcinoma and Hct-116 colon carcinoma cells was carried out using two pro-oxidative compounds (TNF-α and Doxorubicin) and transient overexpression of antioxidant enzyme catalase. For MCF-7 cells a clear connection between TNF-α mediated cytotoxicity and intracellular amounts of H2O2 was shown. Catalase overexpression in MCF-7kat cells resulted in increased TNF-α mediated cytotoxicity and apoptosis. Concurrently, redox-sensitive transcription factor NF-κB showed only transient activation in MCF-7kat cells. This was due to a lack of sufficient H2O2 to co-stimulate NF-κB activation as demonstrated by the observation that addition of exogenous H2O2 led to a second increase of NF-κB activity. Results for MCF-7wt cells further supported the crucial role of H2O2 in TNF-α mediated cytotoxicity. TNF-α treatment of MCF 7wt cells elicited sustained NF-κB activation which was accompanied by downregulation of catalase and induction of MnSOD expression. These results indicate that TNF-α mediated differential regulation of MnSOD and catalase in MCF-7wt cells and accordingly, elevated levels of H2O2 are required for appropriate function of the NF-κB dependent survival pathway. FOXO3a, a member of the FOXO superfamily, is another redox-sensitive transcription factor which can be regulated in a H2O2 dependent way. In the present study reduction of intracellular H2O2 levels by overexpressing catalase, resulted in nuclear exclusion of FOXO3a. Overexpression of FOXO3a caused an increased catalase expression which further supported the close connection between FOXO3a activity and catalase expression in MCF-7 cells. TNF-α mediated downregulation of catalase expression and subsequent accumulation of H2O2 in MCF-7wt cells was accompanied by nuclear exclusion of FOXO3a. In contrast, MCF-7kat cells with insufficient intracellular amounts of H2O2 showed nuclear import of FOXO3a after TNF-α treatment. Additionally, overexpression of constitutive active FOXO3a enhanced TNF-α mediated cytotoxicity. These results suggest that regulation of redox-sensitive transcription factor FOXO3a is dependent on intracellular amounts of H2O2. Furthermore, intracellular redox state itself can be modulated by a FOXO3a dependent regulation of the antioxidant enzym catalase. Since the first part of this study showed that sufficient amounts of intracellular H2O2 are a necessity for functional activation of NF-κB, the outlined FOXO3a catalase signaling could account for heightened TNF-α mediated cytotoxicity in FOXO3a overexpressing cells. The cytostatic drug Doxorubicin which is often used in treatment of solid tumors can among others function as a redox cycler and induce accumulation of ROS. Therefore, the second part of this study investigated the role of H2O2 in regulating redox-sensitive transcription factors and its connection to doxorubicin mediated cytotoxicity in Hct-116 colon carcinoma cells. Doxorubicin treatment resulted in accumulation of ROS and downregulation of catalase expression. However, contrary to our results with TNF-α accerelated decomposition of H2O2 by overexpressing catalase had no effect on doxorubicin mediated cytotoxicity. Short time (3h) doxorubicin incubation resulted in p53 and p21 dependent G2/M arrest and subsequent apoptosis which was likely to be c-Myc dependent. In contrast, 24 h incubation with higher doxorubicin concentrations elicited complete block of transcription and translation and cell cycle arrest before G2/M phase entry. FOXO4 is another member of the FOXO superfamily of redox-sensitive transcription factors and is involved in control of cell cycle arrest and apoptosis. FOXO4 can be transcriptionally activated by a JNK mediated phosphorylation. Doxorubicin caused accumulation of ROS and phosphorylation of JNK in Hct-116 cells. However, both were of no effect on FOXO4 and doxorubicin mediated cytotoxicity in Hct-116 cells. Instead, a connection between PI3K/AKT/FOXO4 signaling and doxorubicin mediated cytotoxicty could be found. A doxorubicin mediated activation of AKT and consequential phosphorylation and nuclear exclusion of FOXO4 was detected in Hct-116 cells. Based on these findings sensitization of Hct-116 cells to doxorubicin could be achieved in this study. Overexpression of FOXO4 or dominant negative AKT rendered cells more sensitive to doxorubicin mediated cytotoxicity and apoptosis. These results indicate that inhibition of PI3K/AKT signaling or activation of redox-sensitive transcription factor FOXO4 may lead to new chances in sensitizing cancer cells to cytotoxic drugs.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	22.01.2009
Dateien geändert am:	13.01.2009
Promotionsantrag am:	10.11.2008
Datum der Promotion:	08.01.2009