Dokument: Charakterisierung von Viroid-spezifischen „silencing“-RNAs
| Titel: | Charakterisierung von Viroid-spezifischen „silencing“-RNAs | |||||||
| Weiterer Titel: | Characterization of viroid-specific ”silencing“-RNAs | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=10108 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20090114-101555-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Diermann, Natalie Yvonne [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Steger, Gerhard [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Beye, Martin [Gutachter] Prof. Dr. Riesner, Detlev [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | RNA, Viroid, PSTVd, Tomate, Solanum lycopersicum, Rutgers, Silencing, miRNA, small RNAs, Solexa Sequenzanalyse, High-Throughput-Sequenzierung | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Viroide sind einzelsträngige, zirkuläre RNA-Moleküle, die autonom in der Wirtspflanze replizieren
und die biologische Wirkung eines normalen Pflanzenvirus besitzen. Anders als RNA-Viren besitzt die Viroid-RNA kein Hüllprotein und kodiert keine Proteine, wodurch sie für alle biologischen Aktivitäten auf die Wirtsmaschinerie angewiesen ist. Das in dieser Arbeit verwendete Potato Spindle Tuber Viroid (PSTVd) gehört zur Familie der Pospiviroidae und verursacht je nach Stamm unterschiedlich starke Krankheitssymptome in der Tomatenvarietät Rutgers. Das aktuelle Pathogenitätsmodell behauptet, dass von Viroiden „silencing“-RNAs produziert werden und diese über einen der „RNA-silencing“-Wege in die Genregulation des Wirts eingreifen. Bei der Pflanze und somit auch beim Viroid wird angenommen, dass das „RNA-silencing“ über den miRNA-Weg abläuft, aber, wie beim siRNA-Weg, in der Spaltung der mRNA endet. Hierzu wird die pri-miRNA über die pre-miRNA zur reifen miRNA durch die Enzyme DCL1 und HYL1 prozessiert. Nach Einbau der reifen miRNA in einen RISC (RNA-induced silencing complex) wird dieser zur Ziel-mRNA geführt, die nahezu perfekt gebunden wird und dadurch die mRNA gespalten. Bei PSTVd kann entweder die maturierte RNA oder ein Replikationsintermediär als pri-miRNA agieren, was zur Erzeugung von miRNAs aus wenigen, bestimmten Positionen der PSTVd RNA führen würde. Alternativ könnten doppelsträngige Replikationsintermediäre in siRNAs beliebiger Sequenz gespalten werden. Northernblot-Analysen zum Nachweis PSTVd-spezifischer RNAs haben gezeigt, dass die Bereiche aus denen die RNAs stammen, nicht durch Sonden, die jeweils ein Viertel des PSTVd abdecken, einzugrenzen waren. Allerdings konnten kurze RNAs beider Polarität nachgewiesen werden. Durch Auftrennung mittels Gelelektrophorese und Elektro-Gelelution war es möglich, kurze RNAs in μg-Mengen und ohne Verluste durch eventuelle Voraufreinigungen aus Gesamt- RNA zu erhalten. Diese kurzen PSTVd-spezifischen RNAs sollten anschließend durch eine spezifische Dynabead-Aufreinigung von der Gesamt-RNA getrennt werden. Zur Sequenzierung der PSTVd-spezifischen Sequenzen wurde eine Solexa-Sequenzierung durchgeführt. Bei dieser High-Throughput-Sequenzierung wurden zuerst die eluierten miRNAs in cDNA umgeschrieben. Hierbei wurden unterschiedliche Barcodes zusätzlich zu den 3’- und 5’-Adaptern anligiert, damit mehrere Proben parallel sequenziert werden konnten. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit Datenbanken, dem Viroid und untereinander verglichen, um ihnen Funktionen zuzuordnen. Hierbei kristallisierten sich sechs annotierte miRNA-Familien, sowie eine einzelnen miRNA heraus, die mit den Blättern (Form, Farbe, Ausbildung) oder dem Wachstum, in der Regel bei Arabidopsis, in Verbindung gebracht werden. Da Veränderungen dieser Bereiche bei infizierten Pflanzen auftreten, könnten diese miRNAs in Verbindung mit der Viroid-Pathogenese stehen. Die Mehrzahl der PSTVd-spezifischen RNAs stammt aus der virulenzmodulierende Region von PSTVd. Da hier die Sequenzunterschiede der unterschiedlich pathogenen Viroid-Stämme liegen, weist dies auf eine miRNA-regulierte PSTVd-Pathogenität hin.Viroids are single-stranded, circular RNA molecules that replicate autonomously in the host plant and have the same biological effects as an ordinary plant virus. Different to RNA viruses, viroids possess no capsid and do not code for any protein; thus they have to use the host machinery for all biological activities. In this work the potato spindle tuber viroid (PSTVd) is used, which belongs to the family Pospiviroidae and leads, depending on the PSTVd strain, to different symptoms in the tomato variety Rutgers. A recent pathogenicity model states that “silencing” RNAs are produced from the viroid that interfere with gene regulation of the host by an “RNA silencing” pathway. In plants — and therefore in viroids, too — it is expected that the “RNA silencing” takes place by the miRNA pathway, but ends in mRNA cleavage like in an siRNA pathway. For this, the pri-miRNA is processed by the enzymes DCL1 and HYL1 to a pre-miRNA and finally to mature miRNA. After integrating the mature miRNA into the RISC (RNA-induced silencing complex), the complex is lead to the target mRNA, binds in near-perfect complementarity and cleaves the mRNA. In case of PSTVd either the mature RNA or a replication intermediate might act as pri-miRNA, which would imply the generation of “miRNA” from a single or a few positions of the PSTVd RNA. Alternatively, double-stranded PSTVd replication intermediates might be cleaved to siRNAs of any PSTVd sequence. Detection of PSTVd-specific RNAs by Northern blot analysis with viroid RNA quarters was not able to define the regions of their origin. Small RNAs of both polarities, however, could be detected. It was possible to obtain μg of small RNAs by separating total RNA via gel electrophoresis and electrophoretic gel elution without loss due to any pre-purification steps. Next, PSTVd-specific small RNAs were purified by Dynabeads from the total RNA. For sequencing of these PSTVd-specific RNAs the high-throughput Solexa technique was used. Eluted miRNAs were transcribed into cDNA; ligation of primers including different bar codes to their 5’ and 3’ ends allowed for sequencing of different samples in parallel. The obtained sequences were compared with sequence databases, the viroid sequence, and among each other in order to assign functions to these sequences. In total six annotated miRNA families plus one miRNA were found; all of them are known to be linked — at least in Arabidopsis — to form, shape and development of leafs or plant growth. Because infected plants have malformations in these areas, these miRNAs might be associated with viroid pathogenicity. The majority of PSTVd-specific RNAs was derived clearly from the virulence-modulating region of PSTVd. Because small sequence differences of particular viroid strains in this region lead to drastic symptom changes, this hints towards a pathogenicity mechanism regulated by a miRNA pathway. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 14.01.2009 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.01.2009 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 07.11.2008 | |||||||
| Datum der Promotion: | 02.12.2008 |
