Dokument: Genotyp-Phänotyp Charakterisierung und Genexpressionsuntersuchungen bei familiären multiplen Exostosen (HME) sowie Funktionsanalysen von Missense-Mutationen im humanen MMR-Protein hMLH1 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Titel:	Genotyp-Phänotyp Charakterisierung und Genexpressionsuntersuchungen bei familiären multiplen Exostosen (HME) sowie Funktionsanalysen von Missense-Mutationen im humanen MMR-Protein hMLH1 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=10075
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090112-112245-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hardt, Karin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,74 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.01.2009 / geändert 12.01.2009
Beitragende:	Prof. Dr. Royer-Pokora, Brigitte [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter]
Stichwörter:	EXT1, EXT2, HME, hMLH1, PMS2, MMR, Hefe-Zwei-Hybrid, Negativ-Dominanter Mutatorphänotyp
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Genomische Stabilität ist vom Einzeller bis hin zum Menschen von großer Bedeutung. Die Reparaturmechanismen einer Zelle sorgen für den kontinuierlichen Erhalt der genomischen Stabilität. Genetische Veränderungen können unter anderem zur Entstehung von Krebs führen. Um dies zu verhindern, gibt es teilweise evolutionär hoch konservierte Mechanismen, die die Zellen vor Mutationen schützen. Die DNA-Fehlpaarungsreparatur ist einer dieser Mechanismen, die von Prokaryoten bis hin zum Menschen konserviert ist und postreplikativ fehlgepaarte DNA repariert. Keimbahnmutationen in Fehlpaarungsreparaturgenen führen u. a. zu einer erhöhten Anfälligkeit für Dickdarmkrebs. Dieses Krankheitsbild wird als HNPCC (Hereditary non-polyposis colorectal cancer) oder auch als Lynch-Syndrom bezeichnet. In HNPCC-Patienten werden in ungefähr 30 % der Fälle Missense-Mutationen gefunden, die zum Einbau einer veränderten Aminosäure in einem Fehlpaarungs-Reparaturprotein führen und dessen Einfluss auf die Funktion des Proteins nicht vorherzusagen ist. Eine funktionelle Analyse solcher Mutationen ist also von großer Wichtigkeit. Als Modellorganismus für diese Analyse diente aufgrund der hohen evolutionären Konservierung die Hefe Saccharomyces cerevisiae. In dieser Arbeit wurden 17 Missense-Mutationen aus HNPCC-Patienten in die ATP-Bindungs- und die hPMS2-Interaktionsdomäne des humanen Fehlpaarungs-Reparaturgens hMLH1 eingeführt und im Hefe-2-Hybrid-System mit seinem Komplexpartner hPMS2 untersucht. Für 8 Allele aus der ATPase-Domäne wurden die Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen quantitativ überprüft. Diese wurden zudem im dominant-negativen Mutatorphänotyp-Assay auf die Störung der Hefe-Fehlpaarungsreparatur durch die Expression der hMLH1-Allele hin untersucht. Zur Bestimmung der Mutationsrate wurde das in Hefe bestehende LYS2A14-Testsystem verwendet. Für eine abschließende Beurteilung der Funktionalität von Allelen wurde ihre Proteinmenge bestimmt. Drei der untersuchten Missense-Mutationen im Bereich der ATPase-Domäne wurden als pathogen eingestuft. Die restlichen 5 Allele konnten nicht mit Bestimmtheit als pathogen eingestuft werden, zeigen aber einen deutliche Tendenz in diese Richtung. Ein weiterer Bereich dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Untersuchung von Familien, die an der Erkrankung der multiple hereditären Osteochondrome (MO) leiden. MO ist eine dominant vererbte Krankheit mit einer Häufigkeit von 1:50 000. Bei Osteochondromen handelt es sich um Auswüchse an den langen Röhrenknochen. Während der Hauptwachstumsphase in der Kindheit bis zur Pubertät besitzen sie ihre größte Wachstumsaktivität. In dieser Arbeit wurde unter anderem der Zusammenhang zwischen Genort und Ausprägung der Erkrankung untersucht. Hierzu wurden 12 Familien einer sogenannten Kopplungsanalyse unterzogen und mittels Mikrosatellitenmarkern wurde der Genort eingeschränkt. Anschließend wurde eine Mutationsanalyse des identifizierten Genortes mittels DHPLC-Analyse durchgeführt. In Erhebungsbögen wurden klinische Daten der betroffenen Personen dokumentiert und mit den Ergebnissen dieser Arbeit verglichen, um Aussagen zu einer Genotyp-/Phänotypkorrelation machen zu können. Es konnte ein Zusammenhang zwischen der Schwere der Erkrankung und dem betroffenen Genort hergestellt werden. Demnach sind EXT1-Patienten häufig schwerer betroffen als EXT2-Patienten. Weiterhin konnte ein Zusammenhang zwischen dem Verhältnis der Ulnalänge zur Größe eines Patienten und dem Genort EXT1 hergestellt werden. Dieser Parameter kann in der klinischen Diagnostik Anwendung finden, da nun nach der Bestimmung des Verhältnisses Ulnalänge zu Patientengröße eine Vorauswahl getroffen werden kann, welches Gen als erstes in die molekulare diagnostische Untersuchung eingeht. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war der Versuch, Aussagen über die molekularen Unterschiede zwischen Osteochondromen und normalem Knorpelgewebe zu machen. Die Gene EXT1 und 2 kodieren Glycosyltransferasen, welche die Verlängerung der Polysaccharidkette Heparansulfat steuern. Über die Wirkung der Gene auf die Signalwege der Chondrozytendifferenzierung und insbesondere die Frage, auf welche Weise Mutationen der EXT-Gene zu Exostosen führen können, ist jedoch noch wenig bekannt. Molekulare Untersuchungen sollten deshalb einen möglichst breiten Überblick über die Stoffwechselbesonderheiten von Osteochondromzellen liefern. Hierzu wurden aus Tumorgewebe adhärente Primärzellkulturen angelegt und in Arrayuntersuchungen die Genexpression analysiert. Der Vergleich der Transkription von Tumorzellkulturen mit normalen Knorpelkulturen zeigte Expressionsunterschiede von Genen, die in Zusammenhang mit der Entwicklung von Knorpelgewebe gebracht werden können. Die hoch- oder herunter regulierten Gene wurden mittels quantitativer real-time PCR untersucht. In den Tumorzelllinien herunter reguliert waren u. a. die Gene Decorin, Cathepsin D, Kollagen Typ 12, Metalloprotease 2 (MM2) und IHH. Hochreguliert waren Cyclin D1 und PTHrP. Diese Gene sind in Signalwegen der Chondrozytendifferenzierung involviert oder Bestandteil der Extrazelllulärmatrix im Knorpel. EXT1 zeigte weder bei der Arrayuntersuchung noch bei der quantitativen real-time-PCR Expressionsunterschiede. Genome stability is ensured by DNA-repair mechanism and is conserved from bacteria to men. Unrepaired alterations in the DNA can cause diseases for example cancer. One of these repair mechanisms is the highly conserved postreplicative DNA-mismatch-repair system. Germline mutations in the mismatch repair genes are the reason for an increased susceptibility for colon cancer in HNPCC (hereditary non-polyposis colorectal carcinoma) patients. Mutations in DNA repair genes can be nonsense, frameshift or splicesite mutations with clear pathogenicity. 30 % of all HNPCC-patients have missense mutations in the mismatch repair gene hMLH1. The characterisation of the pathogenesis of missense mutations is difficult, because an alteration of an amino acid can influence the function of the protein. Functional analyses of amino acid substitutions are important for the classification of such mutations into pathogenic or non-pathogenic variants. In this work Saccharomyces cerevisiae was used as model organism for the functional analyses of the human mismatch repair protein hMLH1. 17 missense mutations were inserted into the ATPase-domain and the hPMS2-interaction domain of hMLH1 and the interaction with the partner hPMS2 was analysed in a yeast-2-hybrid system (Y2H). Quantitative Y2H-analyses were made for 8 alleles of the ATPase domain. Additionally these mutations were analysed in a system called the dominant negative mutator phenotype assay. The interference of the hMLH1 protein with the yeast mismatch repair system reveals information about the protein function. To determine the mutation rate, an existing yeast LYS2A14 reporter system was used. For further characterisation of the alleles analysed, the protein amount was determined. In these studies three missense mutations in the ATPase domain were classified as pathogenic. The characterisation of the other five missense mutations in the ATPase domain revealed only slight effects on protein function. The analysis of multiple hereditary osteochondroma (MO) was another topic of this thesis. MO is a dominant hereditary disease with a prevalence of 1:50 000. MO is characterised by development of cartilage capped bony outgrowths (osteochondromas) of the long bones and show an increase in size in the first decade of life. Osteochondromas may cause pain, functional problems and deformities especially of the long bones of the extremities. The disease is based on mutations of at least three different genes. In this thesis the correlation between the gene loci and the phenotype of the disease was analysed. For this purpose, family data were collected and the involved gene loci were identified by linkage studies. Mutation detection was performed by DHPLC analysis. Clinical data of patients were collected in the orthopaedic clinic and compared with the results of this work to make a phenotype-genotype correlation. There was a positive correlation between the ratio of the ulna length and height of the patient and the gene locus of EXT1. A further aspect of this work was the finding of molecular differences between osteochondroma and normal cartilage tissue. The genes EXT1 and 2 encode glycosyltransferases, which are involved in the elongation of the polysaccharide chain heparansulfate. Currently there is limited information about signalling pathways involved in the formation of the osteochondroma. Molecular analyses of osteochondroma cells should give further insights into the metabolism. For this purpose, primary adherent cells were created from tumor tissue and analysed in array analyses. The comparison between the transcriptome of tumor cells and normal chondrocyte cells showed deregulated expression of genes, which can be associated with the development of cartilage tissue. The up- or down regulated genes of interest were analysed with quantitative real time PCR analysis. The EXT1-gene itself showed no difference in the array analyses and quantitative real time PCR. There was a down regulation of the genes Decorin, Chathepsin D, Kollagen Typ 12, Metalloprotease 2 (MM2) and IHH. Up regulation was found for Cyclin D1 and PThRP. Some of these genes are involved in signalling pathways during chondrocytes differentiation pointing to a disturbed differentiation; others are components of the extra cellular matrix (ECM) of the cartilage, demonstrating that EXT might be involved in the formation of the correct ECM.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Humangenetik und Anthropologie
Dokument erstellt am:	12.01.2009
Dateien geändert am:	12.01.2009
Promotionsantrag am:	15.10.2007
Datum der Promotion:	11.07.2008