Dokument: Lokalisation und Funktion von pro- und antiapoptotischen Faktoren in Abhängigkeit von verschiedenen Apoptose-Induktoren

Titel:	Lokalisation und Funktion von pro- und antiapoptotischen Faktoren in Abhängigkeit von verschiedenen Apoptose-Induktoren
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=4781
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070612-101721-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Liebmann, Jörg [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,43 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.06.2007 / geändert 12.06.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Suschek, Christoph V. [Gutachter] Prof. Dr. Kunz, Werner [Gutachter] Prof. Dr. Mehlhorn, Hans-Peter Heinz [Gutachter]
Stichwörter:	Apoptose, Caspasen, UVA, Survivin, Stickstoff-monoxid
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Eine gestörte Regulation apoptotischer Vorgänge stellt eine Ursache für viele schwere Krankheiten, wie beispielsweise neurodegenerative Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Krebs dar. Die Kenntnis des Zusammenspiels verschiedener pro- und antiapoptotischer Proteine ist daher essentiell für die Entwicklung neuer Therapieformen und Medikamente. Die von mir durchgeführte Real-Time RT-PCR-Analyse der mRNA-Expression von Smac/DIABLO im Vergleich zu vorangegangenen Untersuchungen von XIAP, einem inhibitor of apoptosis Protein (IAP), zeigt eine gestörte Balance beider Faktoren während der Tumorprogression in humanen Nierenzellkarzinomen (RCC). Dies fördert wahrscheinlich die Therapieresistenz von RCC`s, die sehr unempfindlich gegenüber Krebsmedikamenten und ionisierender Strahlung als Therapieform sind. Survivin, ein weiteres IAP, wird in den meisten bekannten Krebsarten überexprimiert. Die Entdeckung verschiedener Spleißvarianten dieses Proteins mit unterschiedlichem antiapoptotischen Potential legt die Vermutung nahe, dass hier ein Regulationsmechanismus durch die unterschiedliche Expression und Funktion der verschiedenen Varianten in Bezug auf eine Heterodimerisierung und/oder kompetetive Bindung an gleiche Interaktionspartner besteht. Dies setzt eine zumindest zeitweise gleiche Kompartimentierung der Varianten innerhalb der Zelle voraus. In diesem Zusammenhang wurde von mir eine Charakterisierung der beiden Spleißvarianten, mit Hilfe von EGFP markierten Vektorkonstrukten, durchgeführt. Diese zeigt, dass Survivin, wie auch Survivin-2B in Zellen der Interphase im Zytoplasma lokalisiert. Während der späten G1-Phase und der frühen S-Phase des Zellzyklus transloziert Survivin in den Nukleus und fungiert dort als Chromosomal-Passenger-Protein. Dort assoziiert es mit den Zentromeren und bindet im späteren Midbody der sich teilenden Zelle an die Spindelmikrotubuli. Eine solche Lokalisation konnte für die beiden Spleißvarianten nicht nachgewiesen werden. Von mir durchgeführte computergestützte Analysen von Lokalisationssequenzen mit Hilfe des PSORT II Programms zeigen, dass Survivin-Ex3 durch eine Leserasterverschiebung ein nukleäres Lokalisationssignal (NLS) besitzt und im Kern zu finden ist. Eine Deletionsanalyse zeigt, dass dieses NLS funktionell ist. Durch eine Überexpressionstudie mit den verschiedenen Survivin-Vektorkonstrukten kann ich beweisen, dass Survivin die UVA-induzierte Apoptose in humanen Keratinozyten inhibiert. Diese Inhibition wird in Anwesenheit von Nitrit während der Bestrahlung, das photolytisch zu Stickstoffmonoxid (NO) gespalten wird, aufgehoben. Das hier generierte NO inhibiert Caspasen in vitro sowie in humanen Keratinozyten, wie ich mit Hilfe eines Aktivitätstests für Caspase-3 und Western-blot Analysen der behandelten Zellen zeigen konnte. Die Kernmorphologie der in Anwesenheit von Nitrit bestrahlten Zellen weist auf einen parallelen apoptotischen Signalweg hin, der Caspase-unabhängig ist und durch apoptosis-inducing-factor (AIF) vermittelt wird. Anhand von Immunfluoreszenzanalysen kann ich eine Translokation dieses Faktors in den Zellkern nachweisen, wofür das photolytisch generierte NO essentiell notwendig ist. Deregulation of apoptosis is a major cause for several severe diseases including autoimmune diseases, neurodegenerative disorders and cancer. Therefore understanding the interaction of pro- and antiapoptotic proteins is essential for the development of new therapies and drugs. The real time RT-PCR analysis of the mRNA expression of apoptotic Smac/DIABLO in comparison to previous measurements of XIAP, shows a disturbed balance of both factors during tumor progression in human renal cell carcinoma (RCC) favouring XIAP. This potentially promotes therapy resistance of RCC´s which are generally insensitive towards treatment with anti cancer drugs and ionising radiation. Survivin, which belongs to the same protein family as XIAP, is overexpressed in nearly all known tumor types but absent in differentiated adult tissues. Because of the discovery of different splice variants with different antiapoptotic properties, it is tempting to speculate that there is a regulatory mechanism of apoptotic signalling involving heterodimerisation or competitive binding of the different splice variants with the same substrates. A similar localisation within the cell would be a prerequisite for such an interaction. In this context I performed overexpression studies with EGFP-labeled vector-constructs to characterise these two splice-variants. This analysis shows that Survivin as well as Survivin-2B are localised in the cytoplasm during interphase. During mitosis Survivin translocates to the nucleus and associates with the centromeres and the spindle microtubuli acting as a chromosomal passenger protein. This could not be shown for the two splicevariants. Computer assisted sequence-analysis of lokalisationsignals with the PSORT II program reveals that Survivin-Ex3 contains a nuclear localisation signal (NLS) and accumulates in the nucleus. A deletion analysis of this NLS-sequence shows that the signal is functionally active. Performing overexpression studies with the different vector-constructs I could show for the first time that Survivin inhibits UVA induced apoptosis in human keratinocytes. This inhibition is abrogated in the presence of photolytically generated nitric oxide (NO). This generated nitric oxide inhibits the activity of Caspase-3 in vitro and in human keratinocytes as I could show via Caspase-3 activity assays and western-blot experiments. The nuclear morphology of the UVA/nitrite treated cells provides evidence that the treatment results in the induction of a parallel apoptotic pathway which is caspase-independent and mediated by apoptosis-inducing-factor (AIF). On the basis of an immunflourescence analysis I can show that there is translokation of AIF into the nucleus, for which the presence of NO is essential.
Rechtliche Vermerke:	Aus patentrechtlichen Gründen bis 01.01.2008 zurückgestellt
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	12.06.2007
Dateien geändert am:	12.06.2007
Promotionsantrag am:	08.03.2007
Datum der Promotion:	30.05.2007