Dokument: Automatisierung und Kalibrierung des sFIDA-Assays zur frühzeitigen Diagnose von neurodegenerativen Krankheiten

Titel:	Automatisierung und Kalibrierung des sFIDA-Assays zur frühzeitigen Diagnose von neurodegenerativen Krankheiten
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=41234
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170217-104309-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Herrmann, Yvonne Nelly [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 28,18 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.02.2017 / geändert 16.02.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Oldiges, Marco [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Zusammenfassung Proteinfehlfaltungserkrankungen, darunter die Alzheimersche Demenz (AD) und Parkinson-Krankheit (PD), zeigen als pathologisches Merkmal die Akkumulation von aggregierten Proteinen. In der AD wird die Aggregation von amyloid-beta (Abeta) als Auslöser der Krankheit betrachtet. Während in der PD das Protein alpha-synuclein (alpha-syn) zu Fehlfaltung und Aggregation neigt. Nach derzeitigem Kenntnisstand gelten die löslichen Oligomere dieser Proteine als die Spezies mit der stärksten toxischenWirkung und sind dadurch vermutlich ein direkter Biomarker für beide Krankheiten. Der sFIDA-Assay (surface-based fluorescence intensity distribution analysis) ist eine hoch sensitive Methode zur Bestimmung der Konzentration von Abeta- und alpha-syn-Oligomeren als Biomarker für jeweils AD und PD. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Analyse von Standardmolekülen im sFIDA-Assay. Eine weitere Optimierung des sFIDA-Assays stellt die Automatisierung der Assay-Präparation auf einem liquid handling system dar. Der sensitive Nachweis von stabilisierten Abeta-Oligomeren als Standardmolekül im sFIDA-Assay wurde durch die Berechnung der Nachweisgrenze von 18 fM der Oligomere verdünnt in Cerebrospinal Flüssigkeit (CSF) gezeigt. Die Entwicklung und Verwendung von einem neuen Standard in Form von Silica-Nanopartikeln mit kovalent gebundenen Abeta (Abeta-SiNaPs) wurde vorgestellt. Diese Abeta-SiNaPs wurden verwendet, um EDTA als geeignetsten Gerinnungshemmer für die Quantifizierung von Abeta-Oligomeren in Blutplasma zu identifizieren. Die Implementierung des sFIDA-Assay auf einem automatisierten liquid handling system steigert die Robustheit und Sensitivität des Assays. Durch die Automatisierung ist die parallele Verarbeitung von einer hohen Anzahl von Proben möglich ohne die Arbeitsbelastung der Anwender und das Risiko von menschlichen Fehlern zu erhöhen. Für die Untersuchung des automatisierten sFIDA-Assays wurden folgende Assay-Parameter untersucht: Nachweisgrenze, Variationskoeffizient und Linearität. Im Vergleich zur manuellen Durchführung wurde die Nachweisgrenze von Abeta-SiNaPs in CSF im sub-femtomolaren Bereich (0.85 fM) erreicht. Schließlich wurden die Silica-Nanopartikel mit alpha-synuclein (alpha-syn-SiNaPs) hergestellt, um ein Standardmolekül zur Diagnose der PD auf Basis von Oligomeren zu etablieren. Die alpha-syn-SiNaPs wurden in CSF und Puffer verdünnt und eine Nachweisgrenze von 2.5 fM wurde erreicht. Zusammenfassend dienen die Ergebnisse dieser Arbeit als Grundlage zur Verwendung der sFIDA-Technologie im Hochdurchsatz. Dadurch wird die Validierung von Proteinen in Form von Oligomeren, die als Biomarker für AD, PD und anderen Proteinfehlfaltungserkrankungen dienen können, ermöglicht Abstract Protein misfolding diseases including Alzheimer’s disease (AD) and Parkinson disease (PD) are characterized by pathological accumulation of aggregated proteins. In AD, the aggregation of the amyloid-beta peptide (Abeta) is believed to trigger the disease, whereas in PD the protein alpha-synuclein (alpha-syn) is prone to disease-related aggregation. According to the current state of knowledge, soluble oligomers of these proteins are probably the major neurotoxic species and presumably the most direct biomarker in both diseases. The sFIDA assay surface-based fluorescence intensity distribution analysis) is a highly sensitive technology to determine the concentration of oligomeric Abeta and alpha-syn as AD and PD biomarker, respectively. The aim of this work was to develop and analyse standard molecules for the sFIDA assay. Further optimization of the sFIDA assay was introduced by automating the preparative procedure on a liquid handling system. Sensitive detection of stabilized Abeta oligomers as standard molecules in the sFIDA assay was demonstrated by a calculated lower limit of detection of 18 fM oligomers spiked into cerebrospinal fluid (CSF). The development and use of novel standard molecules based on silica nanoparticles coated with Abeta (Abeta-SiNaPs) was described. These Abeta-SiNaPs were further used to identify EDTA as the most suitable anti-coagulant for Abeta oligomer quantitation in blood plasma. The implementation of the sFIDA assay on a robotic liquid handling system enhanced the robustness and the performance of the assay. By sFIDA automation, parallel processing of a high number of samples was possible without increasing the workload for the operator and the chance of human error. For the investigation of the automated sFIDA performance, crucial assay parameters such as limit of detection, coefficient of variation and linearity were determined. In comparison to manual operation, the lower limit of detection could be reduced to the sub-femtomolar range (0.85 fM). Finally, silica nanoparticles coated with alpha-synuclein (alpha-syn-SiNaPs) were produced to establish a standard molecule for oligomer-based diagnostics of PD. The alpha-syn-SiNaPs were spiked into CSF and buffer (PBS) and could be detected down to a limit of 2.5 fM. In conclusion, the results from this work lay the foundation to apply the sFIDA technology in high-throughput validation of oligomeric proteins as biomarkers for AD, PD, and other protein misfolding diseases.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	17.02.2017
Dateien geändert am:	17.02.2017
Promotionsantrag am:	24.10.2016
Datum der Promotion:	24.11.2016