Dokument: Exploration of the potential of the hydroxynitrile lyase from Arabidopsis thaliana in a micro-aqueous organic solvent system

Titel:	Exploration of the potential of the hydroxynitrile lyase from Arabidopsis thaliana in a micro-aqueous organic solvent system
Weiterer Titel:	Exploration of the potential of the hydroxynitrile lyase from Arabidopsis thaliana in a micro-aqueous organic solvent system
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=39187
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160815-111119-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Brahma, Aischarya [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,42 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.08.2016 / geändert 09.08.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Martina Pohl [Gutachter] Prof. Dr. Karl-Erich Jaeger [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In der Industrie besteht ein wachsender Bedarf an biokatalytischen Prozessen zur Herstellung von Bulk- und Feinchemikalien. Cyanhydrine, die durch die Hydroxynitrillyase (HNL)-katalysierte Hydrocyanierung von Aldehyden und Ketonen entstehen, sind wertvolle chirale Bausteine für die pharmazeutische, agrochemische Industrie und die Feinchemie. In dieser Arbeit wurde das Potential einer R-selektiven HNL aus Arabidopsis thaliana unter Verwendung einer neuen His-getaggten Variante untersucht. Die neue Variante zeigte eine fast doppelt so hohe spezifische Aktivität im Vergleich zum Wildtyp-Enzym, bedingt durch die höhere Reinheit bei ähnlichen pH- und Temperaturoptima. Da der Expressionslevel höher und die Reinigungsprozedur kürzer waren, verdoppelte sich auch die Ausbeute an gereinigtem Enzym. Die neue AtHNL-Variante (His6-AtHNL) wurde anschließend hinsichtlich der Hydrocyanierung von aromatischen Ketonen evaluiert, die nicht zu den bevorzugten Substraten des Enzyms gehören. Allgemein werden Ketone langsamer und meist auch mit geringerer Stereoselektivität umgesetzt, was auf die größere sterische Hinderung der Carbonylfunktion, die damit verbundene geringere Nukleophilie, sowie thermodynamische Gründe zurückzuführen ist. Allerdings konnte durch Verwendung eines mikro-wässrigen Reaktionssystems der Umsatz zweier beispielhaft gewählter Ketone (Acetophenon und 2-Fluoracetophenon) relativ zu Literatur­werten auf 40 % bzw. 48 % verdoppelt werden. Das mikro-wässrige Reaktionssystem ermöglichte Produktkonzentrationen von 160-190 mM, was das Potential solcher Reaktions­systeme für die Synthese von Ketoncyanhydrinen zeigt. Allerdings fanden sich starke Hinweise auf eine Enzym-katalysierte Produktracemisierung, was eine sorgfältige Umsatzkontrolle erfordert, um Produkte mit hoher optischer Reinheit zu erhalten. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden auch fünf 2-Hydroxyketone als Substrate für das Enzym untersucht. Obwohl die entsprechenden Cyanhydrine nachgewiesen wurden, konnte eine spezifischen Enzym-katalysierte Hydrocyanierung dieser Substrate nicht nachgewiesen werden, da die erhaltenen Stereoselektivitäten von ca. 20 % auch in der Enzym-freien Kontrolle auftraten. Allerdings konnte eine schwache, jedoch deutliche Beschleunigung der Reaktion für zwei der untersuchen 2-Hydroxyketone durch His6-AtHNL sowie inaktive Varianten dieses Enzyms gezeigt werden. Ergänzende Untersuchungen zur Analyse des elektrostatischen Oberflächenpotentials der His6-AtHNL ergaben Hinweise auf die Natur der beobachteten Reaktionsbeschleunigung durch Interaktion der Reaktionspartner an der Proteinoberfläche. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die biokatalytische Hydrocyanierung vom Batch in einen kontinuierlichen Flussmodus übertragen. Dazu wurde eine Dreischritt-Kaskade, bestehend aus der Lipase-katalysierten Freisetzung von HCN aus Ethylcyanoformiat, der anschließenden His6-AtHNL-katalysierten (immobilisiert auf Celite oder in ganzen Zellen) Hydrocyanierung und einem dritten chemischen Acetylierungsschritt, etabliert. Anschließend wurde dieses Flussreaktorsystem zur Synthese von sechs verschiedenen (hetero)aromatischen O-acetylierten Cyanhydrinen mit ausgezeichnetem Umsatz und sehr guten ee-Werten erfolgreich eingesetzt. There is a growing demand for biocatalytic processes in the industry for synthesis of various bulk and fine chemicals. Cyanohydrins formed by hydroxynitrile lyase (HNL) catalyzed hydrocyanation of aldehydes or ketones serve as valuable chiral building blocks for the pharmaceutical, agro­chemical and fine chemical industry. In this work the potential of an R-selective HNL from Arabidopsis thaliana was deeper explored using a new His-tagged variant. The new variant showed an almost double specific activity compared to the wildtype enzyme, due to the higher purity, and otherwise similar pH and temperature optima like the wiltype enzyme. As the expression level is higher and the purification procedure shorter, the yield of purified enzyme is more than doubled. The new AtHNL variant (His6-AtHNL) was subsequently used to evaluate the biocatalytic hydro­cyanation of aromatic ketones, which are not the preferred substrates of this enzyme. Generally ketones are converted slower and less stereoselective, which is due to the sterical hinderance of the carbonyl function, the lower nucleophilicity, and thermodynamic limitations. However, using a micro-aqueous reaction system, which is well suited for AtHNL, the conversion of two exemplarily chosen aromatic aldehydes (aceto­phenone and 2-fluoroacetophenone) could be increased up to 40 % and 48 %, respectively, which is 2-fold higher compared to similar studies in aqueous-organic two-phase systems described in literature. The micro-aqueous reaction system enabled product concentrations of 160-190 mM, demonstrating the potential of HNL-catalyzed reactions in such reaction systems for the synthesis of aromatic ketone cyanohydrins. However, there is strong indication for an enzyme-catalyzed product racemization, which makes careful control of the conversion necessary to obtain the products with high optical purity. Based on these results also five 2-hydroxy ketones were tested as substrates for the enzyme. Although the respective cyanohydrines could be detected, enzyme catalysis could not specifically be proved for the hydrocyanation of these substrates as the stereoselectivity was almost comparable to the chemical control reaction. However, a weak but clear acceleration in presence of the His6-AtHNL as well as of inactive active site variants could be proved for two of the five tested 2-hydroxy ketones. Additional studies to analyze the electrostatic surface potential (ESP) of the His6-AtHNL gave hints to the nature of this reaction acceleration by interaction of the reaction partners with the enzyme surface. The second part of the work includes the transfer of the biocatalytic hydrocyanation from batch to a continuous flow mode. Therefore, a three-step cascade was established using the initial lipase-catalyzed production of HCN from ethyl cyanoformate, a subsequent hydrocyanation step catalyzed by His6-AtHNL (on Celite or whole cells), and a final in line acetylation of the resulting cyanohydrins. Afterwards the flow reactor system was successfully used for the synthesis of six (hetero)aromatic O-acetylated cyanohydrines with excellent conversion and very good ee.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	15.08.2016
Dateien geändert am:	15.08.2016
Promotionsantrag am:	10.09.2015
Datum der Promotion:	21.10.2015