Dokument: Entwicklung und Anwendung von Einzelzell-Biosensoren zur Verbesserung der Aminosäure-Produktion von Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum
| Titel: | Entwicklung und Anwendung von Einzelzell-Biosensoren zur Verbesserung der Aminosäure-Produktion von Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum | |||||||
| Weiterer Titel: | Development and application of single cell biosensors for the improvement of amino acid production in Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=38903 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20160712-110040-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Mahr, Regina [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Frunzke, Julia [Gutachter] Prof. Dr. Johannes Hegemann [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Biosensors, Amino acid production, Biotechnology, Microbiology | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Im letzten Jahrzehnt hat sich die Anwendung genetisch-kodierter Sensoren als erfolgreich erwiesen, um neue und effiziente Strategien für die Entwicklung mikrobieller Zellfabriken zu etablieren. Biosensoren vergrößern zum einen das Repertoire an Werkzeugen für die Stammentwicklung und ermöglichen zum anderen neuartige Einblicke in Bioprozesse auf Einzelzellebene. Vor allem Biosensoren, die auf bakteriellen Transkriptionsregulatoren basieren und so die intrazelluläre Metabolitkonzentration in ein messbares Signal übersetzen, spielen aufgrund ihrer vielseitigen Einsatzmöglichkeiten eine große Rolle im Metabolic Engineering Bereich.
Obwohl die Natur eine große Anzahl an Transkriptionsregulatoren hervorgebracht hat, damit Zellen intrinsische und extrinsische Signale wahrzunehmen können, gibt es bis heute nur wenige gut untersuchte Regulatoren und entsprechende Zielpromotoren. Dies beeinträchtigt allerdings eine schnelle Identifizierung neuer Sensorkandidaten. Zu diesem Zweck wurde eine Methode entwickelt, welche auf der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) basiert und deren Ziel es ist, schnell neue Promotoren, die durch bestimmte Effektoren aktiviert werden, zu identifizieren, um somit neue und geeignete Bausteine für die Sensorentwicklung zu gewinnen. Das Grundprinzip besteht darin aus einer Escherichia coli Promoter-Sammlung (Promotoren fusioniert an ein autofluoreszierendes Protein) diejenigen Promotoren durch abwechselnde Runden positiver und negativer Selektion anzureichern, die durch Effektoren aktiviert werden können. Dieser Ansatz führte zur Isolierung des mtr Promoters, der durch Phenylalanin aktiviert wird. Die Evaluierung unterschiedlicher mtr-basierter Biosensoren ergab, dass die Sensorarchitektur einen signifikanten Einfluss auf den dynamischen Bereich und die Effektormolekül-Sensitivität hat. Zudem wurden mit Hilfe des mtr Biosensors erfolgreich Zellen mit erhöhter intrazellulärer Phenylalaninkonzentration mittels FACS aus eine E. coli Mutantenbibliothek isoliert. Im Labor durchgeführte adaptive Evolutionsstrategien werden vielseitig angewendet, um Mikroben an Umweltstress anzupassen oder um deren Produktion zu verbessern. Bisher war diese Strategie jedoch nur für phänotypische Merkmale geeignet, die direkt an die Fitness des Organismus gekoppelt sind. Deshalb haben wir eine Sensor-gesteuerte adaptive Evolutionsmethode entwickelt, um die Produktion unscheinbarer Metabolite zu verbessern. Sensorzellen mit dem höchsten Fluoreszenzsignal, was gleichzeitig auf eine erhöhte Metabolit-Produktion hindeutet, wurden mehrmals mittels FACS isoliert und kultiviert. Diese Methode wurde erfolgreich am Beispiel des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex-defizienten Valin-Produktionsstammes Corynebacterium glutamicum ΔaceE etabliert. Hier wurde der Lrp Biosensor verwendet, der für die Detektion von verzweigtkettigen Aminosäuren und Methionine entwickelt wurde. Evolvierte Klone zeigten eine um 25% erhöhte Valin-Produktion und gleichzeitige eine drei- bis vierfach reduzierte Nebenproduktbildung. Durch Genomsequenzierung und anschließender Evaluierung von einzelnen Mutationen im nicht-evolvierten ΔaceE Stamm wurde gezeigt, dass eine Mutation im globalen Regulator GlxR zu einer verringerten Alanin-Produktion führt. Interessanterweise führte der mutationsbedingte Funktionsverlust des Urease akzessorischen Proteins UreD bei Kultivierung im CGXII Minimalmedium zu einer um 100% erhöhten Valin-Bildung. Weitere Experimente zeigten, dass Harnstoff als Bestandteil des Mediums ein zentrales Problem für eine effiziente Valin-Produktion darstellt: Durch den Abbau von Harnstoff zu Ammonium steigt der pH-Wert, was das Wachstum positiv, aber die Produktion negativ beeinflusst. Ebenso zeigte sich, dass die Bildung von Kohlenstoffdioxid die Anaplerose stimuliert, was zu einer reduzierten Pyruvat-Konzentration als Vorstufe der Valin-Biosynthese führt. Zusammenfassend haben die durchgeführten Experimente gezeigt, dass die Produktion von Zellfabriken durch den geschickten und vielseitigen Einsatz von Biosensoren verbessert werden kann. Darüber hinaus bieten Sensoren ein enormes Potential für zukünftige Anwendungen.In the last decade, the application of genetically-encoded biosensors proved successful to establish novel and elaborated strategies for engineering microbial cell factories by enlarging the repertoire of metabolic engineering tools and by enabling unprecedented insights into bioprocesses at single-cell resolution. Especially, biosensors based on bacterial transcriptional regulators translating intracellular metabolite concentration into a measureable output proved to be of high value for a variety of metabolic engineering approaches. Although nature provides a plethora of transcriptional regulators to sense intrinsic and extrinsic stimuli, only a few regulators and their respective target promoters have been well characterized to date. This hampers the prompt decision for suitable sensor candidates. To this end, an elaborated FACS (fluorescence-activated cell sorting)-based strategy was developed for the rapid identification of effector-responsive promoters as suitable parts for biosensor design. Basically, a library of Escherichia coli promoter-auto-fluorescent protein fusions was screened by toggled rounds of positive and negative selection. This approach led to the isolation of the L-phenylalanine-responsive mtr promoter. The construction of different biosensors based on the mtr promoter revealed a significant influence of the sensor’s architecture on the dynamic range and the sensitivity towards effector molecules. Additionally, the mtr biosensor was successfully applied to screen a mutant library of E. coli cells for cells with increased L-phenylalanine productivity. Adaptive laboratory evolution (ALE) has widely been applied to adapt microbes to environmental stress or to improve metabolite production. So far, however, the strategy was only applicable to fitness-linked phenotypes. To this end, we established biosensor-driven adaptive laboratory evolution to evolve inconspicuous product formation. Sensor cells with the highest fluorescent output and hence, increased metabolite production, were iteratively isolated by FACS and re-cultivated. This strategy was successfully applied to the pyruvate-dehydrogenase deficient L-valine producer strain Corynebacterium glutamicum ΔaceE using the Lrp biosensor, which was developed for the detection of branched-chain amino acids and methionine. Evolved clones featured about 25% increased production and 3-4-fold reduced by-product formation. By genome sequencing and the subsequent evaluation of single mutations in the cured ΔaceE background, decreased L-alanine production was attributed to a mutation in the global regulator GlxR. Interestingly, a loss-of-function mutation in the urease accessory protein UreD resulted in about 100% increased L-valine formation in CGXII minimal medium. Further studies demonstrated that urea as part of the cultivation medium imposes a central bottleneck for efficient L-valine production: Urea degradation increases the pH by ammonia release, thereby interfering with growth and L-valine production. Likewise, carbon dioxide formation stimulates anaplerosis leading to a reduced pyruvate pool – the precursor for L-valine production. Altogether, these studies emphasize biosensors as valuable and versatile tools to improve metabolic cell factories with an enormous potential for future applications. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Bezug: | 01.11.2012 bis 27.01.2016 | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 12.07.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 12.07.2016 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 27.01.2016 | |||||||
| Datum der Promotion: | 21.03.2016 |
