Dokument: Molekulare Proteinwechselwirkungen innerhalb eines Photosignalkomplexes in Membranen, untersucht mit fluoreszenzspektroskopischen Techniken

Titel:	Molekulare Proteinwechselwirkungen innerhalb eines Photosignalkomplexes in Membranen, untersucht mit fluoreszenzspektroskopischen Techniken
Weiterer Titel:	Molecular level studies of protein interactions within a photosignal complex in membrane, using fluorescence spectroscopy techniques
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=8322
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20080714-110813-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kriegsmann, Jana [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,65 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.07.2008 / geändert 09.07.2008
Beitragende:	Prof. Dr. Fitter, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In den letzten Jahren wurde detailliertes Wissen über den strukturellen Aufbau des sensorischen Rhodopsin II (NpSRII) und seines Transducers HtrII (NpHtrII) aus Natronobacterium pharaonis gewonnen. NpSRII stellt als Mitglied der Rhodopsin-Familie ein Modellprotein für G-Protein-gekoppelte-Rezeptoren dar. Zur Erweiterung der Kenntnisse über die Struktur-Funktionsbeziehungen wurde darüber hinaus die Stärke der Komplexbildung in Detergenzpuffer untersucht. Jedoch lagen bisher nur wenige Untersuchungen zur Komplexbildung unter physiologischeren Bedingungen wie in Lipidmembranen vor. Auch zur Bindung bei physiologisch niedrigen Proteinkonzentrationen liegen bisher keine Ergebnisse vor. Die Abschätzung der Bindungsaffinität erfolgte durch Bestimmung des Försterresonanzenergietransfers (FRET) proteingekoppelter Fluorophore bei unterschiedlichen Proteinkonzentrationen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher zunächst die NpSRII/NpHtrII-Dissoziationskonstante in Detergenzpuffer bestätigt (KD = 200 nM) und anschließend die Komplexbildung in einschichtigen Lipidvesikeln (large unilamellar vesicles, LUV) untersucht. Der Vergleich der FRET-Effizienzen von Messungen in Detergenzpuffer und Lipidmembranen zeigt eine deutlich gesteigerte Bindungsaffinität von NpSRII und NpHtrII in Lipidmembranen, die mindestens eine Größenordnung über der in Detergenzpuffer liegt. Diese Ergebnisse unterstützen bisherige Studien, nach denen die in Detergenzpuffer gemessenen Eigenschaften integraler Membranproteine nur begrenzt aussagefähig sind. In weiteren Untersuchungen wurden die Proteoliposomen in größere einschichtige Lipidvesikel (giant unilamellar vesicles, GUV) fusioniert, wodurch ein molares Protein-Lipid-Verhältnis von 1:1.000.000 erreicht wurde und somit eine Annäherung an physiologisch niedrige Proteinkonzentrationen gelang. Anhand dieses Modellsystems wurden mit Hilfe der neuartigen 2-Fokus-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (2fFCS) die Diffusionskoeffizienten von fluoreszenzmarkiertem NpSRII und NpHtrII ermittelt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass selbst bei niedrigen Protein-Lipid-Verhältnissen die NpSRII/NpHtrII-Bindung erhalten bleibt. Die Auftragung der Diffusionskoeffizienten in Abhängigkeit des Zylinder-Radius R ergibt eine 1/R-Abhängigkeit. Dies bestätigt jüngere Studien, die im Widerspruch zum weitverbreiteten Modell von Saffman und Delbrück eine stärkere Abhängigkeit zwischen dem Diffusionskoeffizienten und dem Zylinder-Radius eines diffundierenden Partikels beschreiben. During the past few years detailed knowledge of the structure of sensory rhodopsin II (NpSRII) and its cognate transducer HtrII from Natronobacterium pharaonis has been gained. NpSRII, a member of the rhodopsin family, serves as a model protein for G-protein coupled receptors. To increase the state of knowledge of the relations between structure and function, earlier studies determined the strength of NpSRII/NpHtrII-binding in detergent buffer. However, little is known about the complex formation in more physiological conditions like in lipid membranes. Binding studies for low protein concentrations as they occur in N. pharaonis have not been performed to this date. The evaluation of NpSRII/NpHtrII-binding was implemented by measuring Förster resonance energy transfer (FRET) of fluorescently labelled proteins at different concentrations. In this work the dissociation constant of NpSRII/NpHtrII in detergent buffer (KD = 200 nM) was reproduced and the complex binding in large unilamellar vesicles (LUV) was analyzed, subsequently. A comparison of FRET-efficiencies, as observed for proteins in detergent buffer and in lipid membranes, shows increased binding affinities of NpSRII and NpHtrII in lipids of at least one order of magnitude. Hence, these results support previous studies, which show that the results observed in detergent buffers are limited in their informational value. In further studies the proteoliposomes were incorporated into giant unilamellar vesicles (GUV) by peptide-induced membrane fusion, to mimic physiologically low protein concentrations. This led to a molar protein-lipid-ratio of 1:1,000,000, as it occurs in bacteria. From this model system exact diffusion coefficients of fluorescently labelled NpSRII and NpHtrII were determined by using the new 2fFCS-technique (two-focus fluorescence correlation spectroscopy). The results indicate, that the NpSRII/NpHtrII-binding is observed even at physiologically protein concentration. The diffusion coefficients were proportional to the inverse cylinder radius of the proteins. This is in the line with recently published studies that show discrepancies to the far spread model of Saffman and Delbrück.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	09.07.2008
Dateien geändert am:	09.07.2008
Promotionsantrag am:	26.04.2008
Datum der Promotion:	26.06.2008