Dokument: New and optimised thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes for carboligation- Creation of a toolbox for chiral 2-hydroxy ketones

Titel:	New and optimised thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes for carboligation- Creation of a toolbox for chiral 2-hydroxy ketones
Weiterer Titel:	Neue und optimierte Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängige Enzyme zur Carboligation- Aufbau eines Werkzeugkastens zur Synthese chiraler 2-Hydroxyketone
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=8296
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20090304-100650-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Gocke, Dörte [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,03 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.02.2009 / geändert 17.02.2009
Beitragende:	PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	biocatalysis, thiamine diphosphate dependent enzymes, carboligation, enzymatic asymmetric synthesis, 2-hydroxy ketones
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Various thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes catalyse the carboligation of aldehydes to chiral 2-hydroxy ketones with high stereoselectivity. Since 2-hydroxy ketones are versatile building blocks for organic syntheses, the aim of the thesis was the creation of a ThDP-dependent enzyme toolbox in order to access a diversely substituted and enantio¬complementary 2-hydroxy ketone platform. Several goals could be achieved: 1. Development of a quick and reliable high-throughput assay to screen large toolboxes of purified enzymes or whole cell catalysts for the product formation of diversely substituted 2-hydroxy ketones. 2. Enlargement of the enzyme toolbox by six wild type enzymes and four variants showing carboligase activity. The platform now encompasses 15 wild type 2-keto acid decarboxylases and two benzaldehyde lyases as well as 70. For almost all newly added enzymes a biochemical characterisa¬tion of the substrate spectrum for the decarboxylase and carboligase activity including the determination of optimal reaction conditions was conducted. 3. With the new catalysts and the high-throughput assay an effective enlargement of the 2-hydroxy ketone platform was achieved. Branched-chain aliphatic 2-hydroxy ketones, substituted (R)-phenylacetylcarbinol-analogue products as well as several (S)-2-hydroxy ketones are now for the first time biocatalytically available. By combining decarboxylase activity and carboligase activity the ligation of instable aldehydes is also possible. (S)-selective C-C bond formation was possible due to an understanding of the underlying structure-function relationship of the active site. By gaining two further wild type crystal structures the pool of structure information was broadened. Superimposition of all known structures combined with biochemical information and modelling studies enabled the mapping of catalytically important regions in the active site. It was concluded that the substrate ranges of both, the decarboxylase and the ligase activity of ThDP-dependent enzymes as well as the chemo- and enantioselectivity of the carboligase reaction is a result of optimal stabilisation of the substrates in the active site. This knowledge paves the way for product prediction by modelling studies and therewith the design of new catalysts with desired ligase activity. Die Carboligation von Aldehyden zu chiralen 2-Hydroxyketonen wird von einer Vielzahl Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängiger Enzyme mit hoher Stereoselektivität katalysiert. Da diese chiralen Verbindungen als Ausgangsstoffe zahlreicher organischer Synthesen dienen, war der Aufbau einer Plattform vielfältig substituierter und enantiokomplementärer 2-Hydroxyketone durch Bereitstellung eines Baukastens ThDP-abhängiger Enzyme Ziel dieser Doktorarbeit. Folgende Ergebnisse führten zur erfolgreichen Umsetzung der Aufgabenstellung: 1. Entwicklung eines schnellen, reproduzierbaren Hochdurchsatz-Tests zur Untersuchung der Produktbildung in Ganzzelltransformationen sowie einer Vielzahl gereinigter Enzyme. 2. Vergrößerung des Enzymbaukastens durch Hinzufügen von sechs Wildtypenzymen und vier Varianten mit Carboligaseaktivität. Die biochemische Charakterisierung des Substrat¬spektrums der Decarboxylase- sowie Carboligaseaktivität inklusive Bestim-mung optimaler Reaktionsbedingungen wurde für fast alle neuen Enzyme durchgeführt. 3. Durch die neugewonnenen Biokatalysatoren und den Einsatz des Hochdurchsatz-Tests konnte die Plattform an diversen 2-Hydroxyketonen wesentlich erweitert werden. Verzweigtkettige aliphatische 2-Hydroxyketone, substituierte (R)-Phenyl¬acetyl¬carbinol-analoge Produkte sowie verschiedene (S)-2-Hydroxyketone sind nun erstmalig enzymatisch zugänglich. Durch die Kombination der Decarboxylase- und Ligaseaktivität ist eine Ligation instabiler Aldehyde mit ThDP-abhängigen Decarboxylasen möglich. Die (S)-selektive Carboligation wurde erst durch die Aufklärung der Struktur-Funktionsbeziehungen im aktiven Zentrum ermöglicht. Zusätzlich zu den bereits bekannten Strukturen konnten zwei weitere Wildtyp-Kristallstrukturen gelöst werden. Durch Übereinanderlagerungen aller Strukturen, Modellierungen und Berücksichtigung entstehender Produkte konnten katalytisch wichtige Regionen im aktiven Zentrum kartiert werden. Das Substratspektrum der Decarboxylase- als auch Carboligaseaktivität der Enzyme sowie ihre Chemo- und Enantioselektivität ist ein Ergebnis optimaler Substrat¬stabilisierung im aktiven Zentrum. Diese Erkenntnis ermöglicht den Zugang zur Vorhersage gebildeter Produkte durch Modellierungen und somit zur Entwicklung von Katalysatoren mit gewünschter Ligaseaktivität.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	04.03.2009
Dateien geändert am:	17.02.2009
Promotionsantrag am:	12.08.2007
Datum der Promotion:	14.04.2008