Dokument: Biosynthese von Aryltetralin-Lignanen in Linum album - Biochemie und Molekularbiologie der "späten"-Schritte

Titel:	Biosynthese von Aryltetralin-Lignanen in Linum album - Biochemie und Molekularbiologie der "späten"-Schritte
Weiterer Titel:	Biosynthesis of Aryltetralin-Lignans in Linum album - Biochemistry and molecular Biology of the "late"-steps
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=5553
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070903-143149-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Federolf, Katja [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,98 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.08.2007 / geändert 20.08.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Alfermann, August-Wilhelm [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Stichwörter:	Linum album, Podophyllotoxin, Deoxypodophyllotoxin, Aryltetralin-Synthese
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Pflanzen und Zellkulturen von Linum album sind in der Lage, cytotoxische Aryltetralin-Lignane zu produzieren, von denen das Podophyllotoxin (PTOX) in chemisch derivatisierter Form als Krebstherapeutikum Anwendung findet. Lignane sind Abkömmlinge des Phenylpropanstoffwechsels. Das Grundgerüst der Aryltetraline besteht aus Coniferylalkohol-Dimeren, die über ihre 8 - 8’ Atome stereospezifisch miteinander verknüpft sind. Die einzelnen Syntheseschritte bis zu Deoxypodophyllotoxin (DOP) sind noch weitestgehend unbekannt. Von DOP ausgehend wurden zwei Wege postuliert: zum einen kann DOP durch Hydroxylierung an Position 7 in Podophyllotoxin (PTOX) überführt werden und zum anderen kann durch Hydroxylierung an Position 6 β-Pelta-tin gebildet werden. β-Peltatin wird in Folge durch eine O-Methyltransferase in β-Peltatin-A-Methylether (PAM) umgewandelt, welches schließlich in 6-Methoxypodophyllotoxin (6MPTOX) überführt wird. Während die Enzyme, die die Umsetzungen von DOP zu β-Peltatin (Deoxypodophyllotoxin 6-Hydroxylase, DOP6H) und von β-Peltatin zu PAM (β-Peltatin 6-O-Methyltransferase, βP6OMT) bereits charakterisiert sind, fehlten zu den Umsetzungen von DOP zu PTOX (Deoxypodophyllotoxin 7-Hydroxylase, DOP7H) und von PAM zu 6MPTOX (β-Peltatin-A-Methylether 7-Hydroxylase, PAM7H) noch jegliche Informationen. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Suche nach den DOP7H und PAM7H Reaktionen. Für die Untersuchun-gen wurden zwei Zellsuspensionskulturen mit den Methoden der Phytochemie, Enzymatik, Proteinanalytik und Molekularbiologie verglichen. Bei Linie 6M handelt es sich um eine 6MPTOX akkumulierende Kultur, während Linie PT vorwiegend PTOX anreichert. Das unterschiedliche Lignanakkumulierungsmuster kommt vermutlich durch das differentielle Vorkommen der DOP6H zustande. Neben der DOP6H konnte in diesen Zellkulturen auch die βP6OMT erstmals nachgewiesen werden. Beide Enzyme wurden aus diesem Grund eingehend hin-sichtlich ihrer pH- und Temperaturoptima und ihrer Michaelis-Menten Kinetiken untersucht. Die DOP6H kann als Cytochrom P450 (CYP)-Enzym in-vitro durch entsprechende CYP-Hemmstoffe inhibiert werden. Hemmki-netiken mit einigen dieser Hemmstoffe deuten auf eine gemischte- bzw. nicht-kompetitive Hemmung hin. Während die DOP6H Reaktion auch in-vivo durch CYP-Hemmstoffe inhibiert werden kann, zeigen Dioxy-genase-Hemmstoffe keinen Einfluss. Im Gegensatz dazu zeigte keiner dieser Inhibitoren eine Beeinflussung der DOP7H Reaktion. Aus diesem Grund kann lediglich die Gruppe der CYP-Enzyme für die DOP7H Reaktion ausgeschlossen werden. Die Hemmexperimente lieferten ebenfalls keinen Hinweis auf die PAM7H Reaktion. Die Zugabe von DOP zu Zellen der Linie 6M führte zu einer verstärkten Bildung von β-Peltatin und PAM, während in Linie PT das zugegebene DOP in PTOX überführt wurde. Dies zeigte, dass DOP tatsächlich der Verzweigungspunkt zu PTOX bzw. 6MPTOX zu sein scheint. Bisher wurde vermutet, dass auch eine Umwand-lung von PTOX in 6MPTOX möglich sein könnte. Die Gabe von PTOX zu Zellen beider Linien resultierte aber in der Bildung des PTOX-Glucosids und nicht in der Bildung von 6MPTOX. Umfangreiche enzymatische Teste auf CYP-, Dioxygenase- und Peroxidase-Enzyme lieferten ebenfalls keinen Hinweis auf den involvierten Enzymtyp einer DOP7H oder PAM7H Reaktion. Allerdings konnte eine bisher unbekannte ‚PTOX:UDP-Glucosyltransferase’ Reaktion gefunden werden. Die Proteomanalyse der beiden Zellinien ergab insgesamt 85 Proteinbanden, die als unterschiedlich starke Banden mit bloßem Auge sichtbar waren. Aus Kostengründen konnten jedoch nur vier davon massenspektrometrisch untersucht werden. Die Ergebnisse wiesen auf eine putative Sucrose Synthase und ein HSP-Protein aus Zellen der Linie PT hin. Hinweise auf CYP- oder Dioxygenase-Enzyme konnten nicht gefunden werden. Effektiver schien der mole-kularbiologische Vergleich der Zellen mittels der Suppressiven-Subtraktions-Hybridisierung. Die Verifizierung der differentiell exprimierten Gene konnte bisher nur mittels Macroarray-Analysen erfolgen. Von insgesamt 671 untersuchten cDNAs der Linie 6M schienen 16 % bzw. von 563 untersuchten cDNAs Sequenzen der Linie PT 23 % differentiell exprimiert zu sein. Darunter befanden sich 42 %, die nach Blastx-Suche keine Ähnlichkeit zu bekannten Sequenzen zeigten. Für den Primärstoffwechsel, den Aufbau der primären Zellwände, Transport-prozesse, Proteinmarkierung, O2-Speicherprozesse, RNA- oder DNA-Bindung, die Tranlsation und die Trans-kription kodierten jeweils 1 - 10 putative cDNA-Sequenzen, während für Sekundärstoffwechselenzyme zwei kodierende cDNA-Sequenzen gefunden wurden. Dabei handelt es sich um ein zu Hydroxyzimtsäure CoA-Ligase ähnliches Protein - einem Enzym des Phenylpropanstoffwechsel und eine β-Amyrin Synthase (Prenyl-transferase, Squalen Oxidase) - einem Enzym der Oxidosqualen Synthese. Neben der Sequenz der β-Amyrin Synthase wurden acht cDNA-Sequenzen, bei denen die Funktion der kodierenden Proteine z.T. noch unbe-kannt ist, als interessant im Hinblick auf die Lignan-Biosynthese erachtet und sollen für weitere Untersuchun-gen genutzt werden. Cell suspension cultures and plants of Linum album can accumulate cytotoxic aryltetralin-lignans like podophyllotoxin (PTOX), which can be used as its semisynthetic derivative in anticancer-therapy. Lignans are a class of secondary metabolites derived from two phenylpropanoid units that are linked by a C-C bond between 8 and 8' of the side chain carbon atoms. The single steps to give deoxypodophyllotoxin (DOP) are rather unknown. But DOP might be the branching point to either PTOX or 6MPTOX. DOP can be hydroxylated at position 7 to give PTOX or the hydroxylation can occur at position 6 to give β-peltatin. β-peltatin is converted by an O-methyltransferase to β-peltatin-A-methylether (PAM), whereas PAM is transformed into 6-methoxypodophyllotoxin (6MPTOX). The enzymes that convert DOP to β-peltatin (deoxypodophyllotoxin 6-hydroxylase, DOP6H) and β-peltatin to PAM (β-Peltatin 6-O-methyltransferase, βP6OMT) are known. The enzymes converting DOP to PTOX (deoxypodophyllotoxin 7-hydroxylase, DOP7H) and PAM to 6MPTOX (β-peltatin-A-methylether 7-hydroxylase, PAM7H) has to be characterized. The aim of this work was to search for the DOP7H and PAM7H reactions. Therefore, two cell suspension cultures of L. album were compared by using methods of pytochemistry, enzymatics, protein analytics and molecular biology. Cell line 6M is a 6MPTOX producer, whereas line PT accumulates mainly PTOX. The differential lignan accumulation pattern may be due to differential occurrence of DOP6H. Beside DOP6H, βP6OMT was detected for the first time in those cell lines. Therefore, both enzymes were char-acterized with respect to pH and temperature optima and their Michaelis-Menten kinetics. The cyto-chrome P450 (CYP) enzyme DOP6H can be inhibited in-vitro by CYP-inhibitors. Kinetics with some of those inhibitors indicate a mixed-type or non-competitive inhibition. The DOP6H reaction can also be inhi-bited in-vivo by CYP-, but not by dioxygenase-inhibitors. In contrast, none of those inhibitors showed any influence on DOP7H. For that reason the group of CYP-enzymes involved in the DOP7H reaction can be entirely excluded. Similar inhibition experiments gave no clue on the enzyme type involved in PAM7H reaction. The feeding of DOP to cells of line 6M resulted in an accumulation of β-peltatin and PAM, whereas in line PT PTOX was formed, showing, that DOP really seems to be the branching point either to PTOX or 6MPTOX. Until now it was speculated that PTOX could be transformed into 6MPTOX, but fee-ding of PTOX to cells of both lines resulted in formation of PTOX-gucoside and not in 6MPTOX-glucoside formation. Extensive enzymatic tests for CYPs, dioxygenases and peroxidases did not throw light on the enzymes involved in DOP7H and PAM7H reactions. Nevertheless, a novel ‚PTOX:UDP-glucosyltransferase’ react-ion could be detected. Comparison of the proteom of both cell lines resulted in 85 protein bands that seemed to be different. Four of the proteins could be analysed by mass spectrometric analysis. The results gave hints for a putative sucrose synthase and a HSP-protein from cell line PT, but no information was found for CYP- or dioxygenase enzymes. Comparison of the cells by suppressive-subtractive-hybridi-zation seemed to be more effective. Verification of the differential expressed genes was done via macro-array-analyses up to now. Altogether 671 cDNAs from line 6M and 563 from line PT were screened and 16 % respectively 23 % seems to be differentially expressed. 42 % of the sequences gave no assign-ment to any known sequence in a blastx-search. One to ten putative sequences encoding for primary metabolism, construction of primary cell wall, processes of transport, protein signposting, O2-reservoir, RNA- or DNA-binding, translation and transcription could be found, whereas two sequences were found encoding for enzymes involved in secondary metabolism. These sequences were hydroxycinnamic acid CoA-ligase like protein from the phenylpropanoid pathway and β-amyrin synthase (prenyltransferase/ squalen oxidase) from the biosynthesis of oxidosqualen. Beside the β-amyrin synthase eight sequences encoding for proteins with partly unknown functions seems to be interesting with regard to lignan biosyn-thesis and will be used for further research.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	20.08.2007
Dateien geändert am:	20.08.2007
Promotionsantrag am:	27.05.0007
Datum der Promotion:	12.06.0007