Dokument: Regulatory and functional aspects of stress-inducible plant metabolite pathways

Titel:	Regulatory and functional aspects of stress-inducible plant metabolite pathways
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=41576
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170321-105111-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Stahl, Elia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,94 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.03.2017 / geändert 21.03.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Zeier, Jürgen [Betreuer/Doktorvater] Prof. Urlacher, Vlada [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das pflanzliche Immunsystem hat mehrere Stufen und beinhaltet konstitutive und induzierbare Abwehrmechanismen. Der Modellorganismus Arabidopsis thaliana, aus der Familie der Brassicaceae, reagiert auf eine Infektion des bakteriellen Pflanzenpathogen Pseudomonas syringae mit Änderungen im Metaboliten-Profil. Die produzierten Metaboliten sind strukturell divers und beinhalten Phenole, Aminosäuren, Indolalkaloide, Terpenoide, Oxylipine, Phytosterole und andere. Einige dieser Metaboliten wirken direkt antimikrobiell, während andere die Expression von Abwehrgenen kontrollieren und damit in regulatorischer Weise zur pflanzlichen Immunantwort beitragen. Diese Arbeit beschreibt weitere, bis jetzt nicht beschriebene, Metabolitenbiosynthesewege in Arabidopsis, die in Folge einer Pseudomonas syringae-Infektion aktiviert werden. Tocopherole sind eine Gruppe von lipophilen Antioxidanten, die ausschließlich von Photosynthese-betreibenden Organismen synthetisiert werden können und in den Plastiden von höheren Pflanzen vorkommen. Man unterscheidet in Pflanzen zwischen vier verschiedenen Formen von Tocopherolen, α-, β-, γ- und δ-Tocopherol. Die vier Tocopherol-Derivate unterscheiden sich durch die Anzahl und die Position der Methylgruppen am Chromanolring. Gene, die für Enzyme kodieren die frühe Schritte der Tocopherol-Biosynthese katalysieren, zeigen erhöhte Transkript-Level in Blättern, die mit virulenten und avirulenten P. syringae infiziert sind. Metaboliten Analysen zeigten, dass eine P. syringae-Infektion zu einer starken Akkumulation von β-Tocopherol führt und zu einer moderaten Produktion von γ- und δ-Tocopherol, während die endogenen α-Tocopherol Level konstant bleiben. Die Mutante vte2 ist vollständig beeinträchtigt in der basalen und P. syringae-induzierten Akkumulation von Tocopherolen, aber nicht in der Produktion von anderen Abwehrmetaboliten. Interessanterweise zeigt diese Mutante eine erniedrigte basale Resistenz gegen P. syringae, welche von erhöhter Lipid-Peroxidation im Falle einer P. syringae-Infektion begleitet ist. Das Fehlen von dreifach ungesättigten Fettsäuren in der vte2-1 fad3-2 fad7-2 fad8 vierfach Mutante verhindert die erhöhte Lipid-Peroxidation im vte2-Hintergrund und stellt eine Resistenz auf Wildtyp Niveau wieder her. Die Ergebnisse zeigen, dass Tocopherole in Arabidopsis zur basalen Resistenz gegen P. syringae beitragen, indem sie Lipide vor oxidativem Schaden schützen. Des Weiteren konnten im Rahmen dieser Arbeit neun N-acetylierte und N-formylierte Aminosäuren identifiziert werden, die in P. syringae infizierten Arabidopsis Pflanzen akkumulieren. Die Akkumulation dieser Aminosäuren ist beeinflusst von JA und Ethylen Signalwegen, aber die funktionelle Relevanz dieser Metaboliten in Arabidopsis gegen bakterielle Pathogene konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht aufgeklärt werden. Ein weiterer Metabolit, der in P. syringae infizierten Arabidopsis Pflanzen akkumuliert, ist Scopoletin. Die Transkript-Level der 2-Oxoglutarate-abähngigen Dioxygenase F6´H1, die für die Scopoletin-Biosynthese in Arabidopsis essentiell ist, sind im Falle einer P. syringae-Infektion erhöht. Eine Arabidopsis Mutante, die in der Scopoletin-Biosynthese via F6´H1 beeinträchtigt ist, zeigt eine leicht erhöhte Anfälligkeit gegen virulente und avirulente P. syringae Stämme. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Scopoletin-Akkumulation zur basalen Resistenz von Arabidopsis gegen bakterielle Pathogene beitragen könnte. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der Indol-Metabolismus umfassend aktiviert wird. Die Akkumulation von Indolalkaloiden ist hierbei nicht nur auf den Infektionsort beschränkt, sondern kann auch in Blättern distal zu der Infektion beobachtet werden. Aus diesem Grund wurde die regulatorische Rolle des Indol-Metabolismus in der systemisch erworbenen Resistenz (SAR) untersucht. In infizierten Blättern konnte die Akkumulation von ca. 20 Indolalkaloiden beobachtet werden. Dabei sind die am stärksten akkumulierenden Indole Camalexin, Indol-3-ylmethylamin (I3A) und Indole-3-Carboxylsäure (ICA). Die exogene Gabe des Pflanzenabwehrhormons Salicylsäure (SA) stimuliert die Produktion von I3A auf Kosten des Biosynthesevorläuferstoffes Indol-3-Methylglucosinolat (I3M). Zudem induziert der SAR-Regulator Pipecolinsäure (Pip) das Priming einiger Zweige des Indol-Metabolismus. Die Akkumulation von Indolalkaloiden in Blättern distal zum Infektionsort ist spezifischer. Hier kann die Akkumulation von drei Indolen beobachtet werden; I3A, ICA und Indole-3-Carbaldehyd (ICC). Die systemische Indol-Akkumulation ist vollständig abhängig von CYP79B2/3, PEN2 und MYB34/51/122, darüber hinaus benötigt sie funktionierende SAR-Signalwege. Die Analyse von Arabidopsis Mutanten zeigte, dass die systemische Indol-Akkumulation nicht zur SAR-Etablierung benötigt wird. Ferner konnte gezeigt werden, dass auf Erde kultivierte cyp79b2/3 und pen2 Mutanten, die beide im Indol-Metabolismus beeinträchtigt sind, eine präaktivierte Immunantwort zeigen, welche ihre Möglichkeit SAR zu etablieren beeinflusst. Dies ist nicht der Fall, wenn cyp79b2/3 und pen2 in einem hydroponischen Medium kultiviert werden. Die Etablierung von SAR in Pflanzen ist abhängig von Pip und SA Signalwegen. Hierbei orchestriert Pip als Hauptregulator der SAR, welcher SAR über SA-abhängige und unabhängige Signalwege kontrolliert. In der Signalkette der SAR-Etablierung agiert SA dabei hinter Pip und der Flavin abhängigen Monooxygenase 1 (FMO1) in der Amplifikation der Abwehrreaktion und ist für eine volle und starke SAR-Reaktion erforderlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht ob der SAR-Hauptregulator Pip als mobiles Langstreckensignal in der SAR-Etablierung fungiert und ob Pip als Vorstufe für andere abwehrrelevante Metaboliten dienen kann. Hierfür wurde mit Deuterium markiertes Pip, in Kombination mit P. syringae, in individuelle Blätter gefüttert. Am Infektionsort kann das gefütterte Pip zu N-formyl-Pip metabolisiert werden und teilweise auch zu α-Amino Adipinsäure (Aad). Des Weiteren kann das gefütterte Pip in zwei FMO1-abhängige Metabolien umgewandelt werden, die im Rahmen dieser Arbeit nicht identifiziert werden konnten. Das gefütterte Pip kann darüber hinaus auch in Blättern distal zur Applikation detektiert werden. Obwohl dieser Transport nicht erhöht ist, wenn Pip in Kombination mit P. syringae in lokale Blätter infiltriert wird, induziert nur eine Co-Infiltration eine partielle systemische Aktivierung von Abwehrreaktionen in Pip-defizienten ald1 Pflanzen, während eine Infiltration von Pip alleine keine systemische Reaktionen in ald1 induziert. Passend zu der partiellen Aktivierung von Abwehrreaktionen in ald1 und der Rolle von FMO1 in SAR, kann die Co-Infiltration von Pip und P. syringae partiell den SAR-Defekt von ald1 Pflanzen kompensieren, aber nicht den von fmo1 Pflanzen. The plant immune system is multilayered and consists of constitutive and inducible defense mechanisms. The cruciferous model plant Arabidopsis thaliana responds to an infection by the bacterial plant-pathogen Pseudomonas syringae rapidly with changes in the plant metabolome. The produced metabolites have a broad structural diversity and include phenolics, protein and non-protein amino acids, indole derivatives, terpenoids, oxylipins, phytosterols, and others. Some of these metabolites possess a direct antimicrobial activity, whereas others act as signals, controlling the expression of defense-related genes and contributing to plant innate immunity by regulatory means. Here, it is reported that several previously uncharacterized metabolite pathways are activated in A. thaliana upon P. syringae-infection. Tocopherols are lipid-soluble antioxidants with vitamin E activity that are synthesized exclusively by photosynthetic organisms and occur in plastids of higher plants. The four known tocopherols, α-, β-, γ- and δ-tocopherol, differ in number and position of methyl groups on their chromanol head group. We realized that inoculation of Arabidopsis leaves with virulent or avirulent P. syringae strains induces increased expression of several genes involved in early steps of tocopherol biosynthesis. Subsequent metabolite analyses revealed that P. syringae inoculation triggers a strong accumulation of β-tocopherol and quantitatively moderate production of γ- and δ-tocopherol in leaves, whereas α-tocopherol levels essentially remain constant. Notably, vte2 which is fully impaired in basal and pathogen-induced tocopherol generation but not in the accumulation of other defense related metabolites, exhibits increased susceptibility towards virulent P. syringae. This is accompanied by increased levels of lipid peroxidation after P. syringae infection in this mutant. The lack of tri-unsaturated fatty acids in a vte2-1 fad3-2 fad7-2 fad8 quadruple mutant prevents increased lipid peroxidation in the vte2 background and restores pathogen resistance to wild-type levels. Our results therefore suggest that basal levels and induced production of tocopherols contribute to Arabidopsis basal resistance against Pseudomonas syringae by preventing oxidative damage of lipids. Moreover, we could identify nine N-acetylated and N-formylated amino acids which accumulate in Arabidopsis in response to P. syringae infection. The P. syringae-inducible accumulation of those metabolites is influenced by JA- and ethylene-signaling. However, the functional relevance of the identified N-acylated amino acids could not be clarified in this study and remains to be elucidated. Additionally, we could identify scopoletin, a methyl coumarin, as a metabolite which accumulates in Arabidopsis upon P. syringae infection. Transcript levels of the 2 oxoglutarate-dependent dioxygenase F6´H1, which is essential for scopoletin biosynthesis in Arabidopsis, are increased upon P. syringae infection. An Arabidopsis mutant plant which is impaired in scopoletin biosynthesis via F6´H1 exhibits a moderate increased susceptibility towards virulent and avirulent P. syringae, suggesting that scopoletin production to some extent contributes to Arabidopsis basal resistance against bacterial plant-pathogens. Furthermore, it is shown that indolic metabolism is broadly activated in P. syringae-inoculated and in distant, non-inoculated leave tissue. We therefore investigated the functional role and the regulatory characteristics of indolic metabolism in systemic acquired resistance (SAR). At inoculation sites, camalexin, indol-3-ylmethylamine (I3A), and indole-3-carboxylic acid (ICA) are the major accumulating compounds, along with about 20 other detected indolics. Moreover, exogenous application of the defense hormone salicylic acid (SA) stimulates I3A generation at the expense of its precursor indol-3-ylmethylglucosinolate (I3M), and the SAR regulator pipecolic acid (Pip) primes plants for enhanced P. syringae-induced activation of distinct branches of indolic metabolism. In uninfected systemic tissue, the metabolic response is more specific and associated with enhanced levels of the indolics I3A, ICA, and indole-3-carbaldehyde (ICC). Systemic indole accumulation fully depends on functional CYP79B2/3, PEN2, and MYB34/51/122, and requires functional SAR signaling. Mutant analyses suggest that systemically elevated indoles are dispensable for SAR directed against P. syringae and associated systemic increases of salicylic acid. However, soil-grown but not hydroponically-cultivated cyp79b2/3 and pen2 plants, both defective in indolic secondary metabolism, exhibit pre-induced immunity, which abrogates their intrinsic ability to induce SAR. The capability of SAR establishment in plants is dependent on Pip and SA signaling pathways. Thereby, Pip functions as the main regulator of SAR, controlling SAR establishment via SA-dependent and –independent pathways. SA acts downstream of Pip and FLAVIN-DEPENDENT MONOOXYGENASE1 (FMO1) in defense-signal-amplification and is necessary for a full and strong SAR response. We therefore further investigated if the main SAR regulator Pip can serve as a precursor for new potential defense related metabolites and investigated a potential role of Pip as a long-distance signal in SAR establishment. We fed deuterium labeled Pip into distinct leaves in combination with an infection with P. syringae. Exogenous fed Pip at the infection-site can be metabolized to N-formyl-Pip and partially also to α-amino adipicacid (Aad). Moreover, Pip can serve as a precursor for two until now not yet identified FMO1-generated metabolites. Furthermore, the exogenous fed Pip could be detected also in leaves distal to the site of application. However, this transport was not increased in wild-type plants which were in addition to Pip-infiltration also infected with Psm. Interestingly, ald1 mutant plants, which are defective in endogenous Pip generation and SAR, could activate systemic defense responses to a certain extent when locally co-infiltrated with both Pip and Psm. By contrast, local Pip- or P. syringae-infiltrations alone were not sufficient to trigger systemic responses in the ald1 mutant. Although able to partially complement SAR-deficiency of ald1, Pip and P. syringae co-treatments could not trigger any SAR response in fmo1 mutant plants, which is consistent with the previously described central function of FMO1 downstream of Pip in SAR activation.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	21.03.2017
Dateien geändert am:	21.03.2017
Promotionsantrag am:	03.05.2016
Datum der Promotion:	01.07.2016