Dokument: Anticancer agents: in vitro analysis of their potential and limitations in melanoma cell death

Titel:	Anticancer agents: in vitro analysis of their potential and limitations in melanoma cell death
Weiterer Titel:	Tumortherapeutika: In-vitro-Analyse ihrer Möglichkeiten und Grenzen anhand des Melanom-Zelltod
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=39109
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20160802-105431-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Porzig, Benjamin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,44 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 31.07.2016 / geändert 31.07.2016
Beitragende:	PD Dr. rer. nat. Santourlidis, Simeon [Gutachter] Prof. Dr. Wesselborg, Sebastian [Gutachter]
Stichwörter:	Melanoma, Bortezomib, Apoptosis, Autophagy
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Das metastasierte Melanom gehört zu den am aggressivsten wachsenden und sehr chemotherapie-resistenten Tumorarten. Die heutzutage verfügbaren therapeutischen Optionen für Patienten mit metastasiertem Melanom sind beschränkt und häufig mit starken Nebenwirkungen assoziiert. Für anti-neoplastische Substanzen sind im Allgemeinen sowohl endoplasmatischer-Retikulum (ER)-Stress als auch mitochondriale Dysregulation potentielle therapeutische Ziele. Die anti-neoplastische Substanz Bortezomib ist ein kleines Molekül das selektiv und speziell Proteasomen inhibiert, und somit zur Induktion sowohl von pro- als auch anti-apoptotischen Proteinen wie Noxa und Mcl-1, führt. Dies erklärt sowohl die erwünschten als auch unerwünschten Effekte, die bei therapierten Patienten zu verzeichnen sind. Daher ist es von besonderer Bedeutung, durch funktionelle Analysen von anti-neoplastischen Substanzen, und deren in Melanomzellen hervorgerufenen Effekten die etablierten heutigen Therapien zu verbessern, um besonders in Fällen von metastasierten Melanomen die therapeutische Effizienz zu erhöhen. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung von anti-neoplastischen Substanzen auf das Zellwachstum von Melanomzellen abzuschätzen, und die molekularen Mechanismen, durch die Bortezomib Apoptose in Melanomzellen auslöst, ausführlich zu charakterisieren. In der vorliegenden Arbeit zeigte sich, dass die Behandlung von Melanomzellen mit Bortezomib, Carmustine, und Dacarbazine zum Zelltod führt. Die funktionelle Analyse von Bortezomib ergab, dass durch die Behandlung der Melanomzellen mit Bortezomib eine Induktion der Apoptose ausgelöst wurde. Auch eine Hochregulierung von den Proteinen: Noxa, Mcl-1 und HSP70 sowie die Spaltung von LC3 mit Bildung von Autophagosomen konnte nachgewiesen werden. Bortezomib induzierte ER-Stress, welcher anhand von intrazellulärer Ca2+ Freisetzung nachgewiesen werden konnte. Des Weiteren führte Bortezomib zu einer gesteigerten Phosphorylierung von IRE1α, ASK1, JNK, p38 als auch zu einer Aktivierung von den Transkriptionsfaktoren AP-1, ATF-2, Ets-1, und HSF1. Die durch Bortezomib ausgelöste mitochondriale Dysregulation konnte sowohl mit Hilfe der Anhäufung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS), Freisetzung von AIF und Cytochrome c, die Aktivierung von caspase-9 und caspase-3 als auch durch die Spaltung von PARP nachgewiesen werden. Es stellte sich heraus, dass eine Vorbehandlung der Melanomzellen mit einem caspase-3 Inhibitor (Z-DEVD-FMK) zu einer verminderten Bortezomib-induzierten Apoptose führte, die letztendlich eine vermehrte Autophagie bewirkte. Einen gegenteiligen Effekt zeigte eine Blockierung von ASK1, so dass es zu einer verminderten Autophagosomen-Bildung, jedoch vermehrter Apoptose kam. Eine Inhibition von JNK oder HSP70 führte ebenfalls zu einer vermehrten Apoptose, jedoch ohne Auswirkungen auf die Bildung von Autophagosomen zu zeigen. Die auf den Inhibitions-Test basierenden Ergebnisse zeigen, dass eine Behandlung von Melanomzellen mit Bortezomib beide Signalwege aktiviert, zum einen den ER-Stress assoziierten Signalweg, als auch den, durch mitochondriale Dysfunktion vermittelten Signalweg Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal die molekularen Mechanismen demonstriert, die es Bortezomib ermöglichen sowohl eine Apoptose, als auch Autophagie in Melanomzellen herbeizuführen. Metastatic melanoma is known as one of the biologically most aggressive and chemo resistant cancers known. The available therapeutic approaches for patients with metastatic melanoma are of limited benefit and commonly associated with numerous adverse effects. Generally, both endoplasmic reticulum (ER) stress and mitochondrial dysregulation are potential therapeutic targets of anticancer agents including bortezomib. Bortezomib is a small molecule that can specifically and selectively inhibit proteasomes, leading to the induction of both pro- and anti-apoptotic proteins, including Noxa and Mcl-1, and thereby leads to the enhancement of desired as well as non-desired effects in treated patients. Therefore, the functional analysis of anticancer agents-induced effects in melanoma cells may help to improve their therapeutic efficiency for the treatment of metastatic melanoma. The aim of the present study was to assess the inhibitory effect of anticancer agents on cell growth of melanoma cells and to characterize, in detail the molecular mechanisms whereby bortezomib triggers apoptosis in melanoma cells. The treatment of melanoma with bortezomib, carmustine, dacarbazine was found to induce apoptosis in melanoma cells. However, the functional analysis of bortezomib in detail was found to induce apoptosis of melanoma cells together with the upregulation of Noxa, Mcl-1, and HSP70 proteins, and the cleavage of LC3 and autophagosome formation. Bortezomib induced ER-stress, as evidenced by the increase of intracellular Ca2+ release and enhanced the phosphorylation of IRE1α, ASK1, JNK and p38, as well as, the activation of the transcription factors AP-1, ATF-2, Ets-1, and HSF1. Bortezomib-induced mitochondrial dysregulation was associated with the accumulation of reactive oxygen species (ROS), the release of both apoptosis inducing factor (AIF) and Cytochrome c, the activation of caspase-9 and caspase-3, and cleavage of Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Furthermore, the pretreatment of melanoma cells with the inhibitor of caspase-3 (Z-DEVD-FMK) was found to block bortezomib-induced apoptosis leading subsequently to increased autophagosome formation. In contrast, the inhibition of ASK1 abrogated bortezomib-induced autophagosome formation and increased induced apoptosis. As a beneficial side effect, the inhibition of JNK, of HSP70 increased also induced apoptosis without influencing bortezomib-induced autophagosome formation. Thus, based on inhibitory experiments, the exposure of melanoma cells to bortezomib triggers the activation of both ER-stress-associated pathways, in particular IRE1α-ASK1-p38-ATF-2/ets-1-Mcl-1, and IRE1α-ASK1-JNK-AP-1/HSF1-HSP70 as well as mitochondrial dysregulation-associated pathways, namely ROS-ASK1-JNK-AP-1/HSF1-70, and AIF-caspase-3-PARP and Cyt.c-caspase-9-caspase-3-PARP. Altogether, we demonstrate for the first time the molecular mechanisms, whereby bortezomib triggers both apoptosis and autophagosome formation in melanoma cells.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	02.08.2016
Dateien geändert am:	02.08.2016
Promotionsantrag am:	18.12.2012
Datum der Promotion:	20.07.2016