Dokument: Analysen zur Funktion von CC2D1A und CC2D1B im endosomalen Transportweg und zur Interaktion mit ESCRT-III Proteinen in Säugern
| Titel: | Analysen zur Funktion von CC2D1A und CC2D1B im endosomalen Transportweg und zur Interaktion mit ESCRT-III Proteinen in Säugern | |||||||
| Weiterer Titel: | Analysis of the function of CC2D1A and CC2D1B in the endocytic pathway and of the interaction with ESCRT-III proteins in mammals | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=38948 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20160714-103632-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Migdal, Bernhard [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Thomas Klein [Betreuer/Doktorvater] Jun.-Prof. Dr. Beller, Mathias [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Proteine der CC2D1/Lgd Familie sind in allen Metazoen konserviert und besitzen vier DM14
Domänen und eine C2 Domäne. In Drosophila wird Lgd für die vollständige Funktion der ESCRT-III Untereinheit Shrub benötigt und sein Verlust zu einer Störung im endosomalen Transportweg führt. Für die beiden Säugerorthologe CC2D1A und CC2D1B wurde eine solche Funktion bisher nicht beschrieben, dafür unter anderem Funktionen in mehreren Signalwegen. Beschrieben wurde bisher nur die in vitro Interaktion von CC2D1A mit allen CHMP4 Isoformen und von CC2D1B mit CHMP4B. In vitro reicht ein Fragment bestehend aus einer DM14 Domäne von CC2D1A für die Interaktion mit einem Fragment von CHMP4B. In Drosophila werden in vivo hingegen mindesten zwei DM14 Domänen für eine Rettung des lgd Phänotyps benötigt. In dieser Arbeit konnte erstmals eine Funktion von CC2D1A und CC2D1B im endosomalen Transportweg nachgewiesen werden. Elektronenmikroskopische Analysen zeigen vergrößerte endolysosomale Kompartimente in Cc2d1a-/- MEF Zellen. In Vps4a+/-;Vps4b+/- MEF Zellen sind „Class E“ ähnliche endolysosomale Kompartimente zu beobachten, welche durch zusätzlichen Verlust eines Cc2d1 Gens kleiner sind. Beim zusätzlichen Ausfall beider Cc2d1 Gene in Vps4a+/-;Vps4b+/- MEF Zellen sind deutlich mehr endolysosomale Kompartimente zu beobachten, welche allerdings nicht mehr den „Class E“ Phänotyp zeigen. Zudem lokalisiert endogenes CC2D1A an vergrößerten Endolysosomen in Vps4a+/-;Vps4b+/- MEF Zellen. Darüber hinaus werden die CC2D1 Proteine durch die ESCRT-III Assemblierung an endosomale Membranen rekrutiert und durch die Auflösung des Komplexes durch VPS4 wieder von dort entfernt. Aufgrund der Ergebnisse kann eine Funktion der CC2D1/Lgd Proteine an der endosomalen Membran „upstream“ von VPS4 vermutet werden. Mittels des PLA Systems konnte erstmals die endogene Interaktion von CC2D1A und CHMP4B in Zellen nachgewiesen werden. Mit Hilfe von FRET-APB Experimenten konnte zusätzlich erstmals gezeigt werden, dass CC2D1A und CC2D1B in lebenden Zellen mit den ESCRT-III Untereinheiten CHMP4A, CHMP4B und CHMP4C interagieren. Des Weiteren wurden mit den Hilfs-ESCRT Proteinen CHMP5 und CHMP7 bisher nicht beschriebene Interaktionspartner identifiziert. Darüber hinaus interagieren die CC2D1 Proteine jeweils mit sich und miteinander. Die Bedeutung der DM14 Domänen von CC2D1B für die Interaktion mit CHMP4B, CHMP4C und CHMP7 wurde ebenfalls genauer charakterisiert. So interagiert CC2D1B über unterschiedliche DM14 Domänen mit Diesen. Zudem konnten für die Interaktion mit CHMP4B und CHMP7 Unterschiede bei den in der dritten DM14 Domäne benötigten, konservierten Aminosäuren gezeigt werden. Mit dem N-Terminus vor der ersten DM14 Domäne beider CC2D1 Proteine und dem verlängerten C-Terminus von CC2D1A wurden zwei neue Domänen identifiziert, welche einen Einfluss auf Lokalisation, Regulation und Interaktion der Proteine haben.Proteins of the CC2D1/Lgd family are conserved throughout all metazoens and consist of four DM14 domains and one C2 domain. In Drosophila, Lgd is needed for the full function of the ESCRT-III subunit Shrub and its loss leads to dysfunctions in the endosomal pathway. For the mammalian Orthologs CC2D1A and CC2D1B none such function was described yet, but amongst others, functions in several signaling pathways were shown. Only an in vitro interaction of CC2D1A with all CHMP4 isoforms and of CC2D1B with CHMP4B was described. A fragment of CC2D1A consisting of only one DM14 domain is sufficient for the interaction with a CHMP4B fragment, in vitro. However in Drosophila at least two DM14 domains are needed in vivo to rescue the lgd mutant phenotype. A function of CC2D1A and CC2D1B in the endosomal pathway could be shown in this study for the first time. Electron microscopy analysis show enlarged endolysosomal compartments in Cc2d1a-/- MEF cells. In Vps4a+/-;Vps4b+/- MEF cells „class E“ like endolysosomal compartments can be observed, which are smaller when additionally one of the Cc2d1 genes was lost. Loss of both Cc2d1 genes in Vps4a+/-;Vps4b+/- MEF cells leads to an increased number of endolysosomal compartments, which however do not show an “class E” like phenotype anymore. Furthermore endogenous CC2D1A localizes at enlarged endolysosomes in Vps4a+/-;Vps4b+/- MEF cells. Moreover CC2D1 proteins are recruited to the endosomal membrane via ESCRT-III assembly and are removed when VPS4 disassembles ESCRT-III. These results suggest, that CC2D1/lgd proteins function at the endosomal membrane upstream of VPS4. By using the PLA system the endogenous interaction of CC2D1A and CHMP4B could be shown directly in cells for the first time. In addition FRET-APB experiments show the interaction of CC2D1A and CC2D1B with the ESCRT-III subunits CHMP4A, CHMP4B and CHMP4C in living cells. Furthermore CHMP5 and CHMP7 were identified as novel interaction partners and it could be shown, that the CC2D1 proteins interact with each other and themselves. The importance of the DM14 domains of CC2D1B was characterized in details regarding the interaction with CHMP4B, CHMP4C and CHMP7. Different DM14 domains of CC2D1B are needed for these interactions. Moreover, the different relevance of conserved amino acids in the third DM14 domain of CC2D1B could be shown in this study. By analyzing the N-terminal part previous of the first DM14 domain of both CC2D1 proteins and the elongated C-terminal part of CC2D1A, novel domains could be described. These domains influence the localization, the regulation and the interactions of the CC2D1 proteins. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Genetik | |||||||
| Dokument erstellt am: | 14.07.2016 | |||||||
| Dateien geändert am: | 14.07.2016 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 09.03.2016 | |||||||
| Datum der Promotion: | 18.05.2016 |
