Dokument: Uptake of the dipeptide-like antibiotic negamycin into bacterial cells

Titel:	Uptake of the dipeptide-like antibiotic negamycin into bacterial cells
Weiterer Titel:	Uptake of the dipeptide-like antibiotic negamycin into bacterial cells
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=37347
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20170309-085953-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schumacher, Catherine [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 21,64 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 28.02.2016 / geändert 28.02.2016
Beitragende:	Prof. Dr. Brötz-Oesterhelt, Heike [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Proksch, Peter [Gutachter]
Stichwörter:	Negamycin
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Infektionserkrankungen und das ansteigende Vorkommen von Antibiotika-resistenten Keimen zählen zu den größten Gesundheitsproblematiken der heutigen Zeit. Inzwischen gehören sie zu den sechst-häufigsten Todesursachen in Europa [1]. Die Entdeckung und Entwicklung neuer antibakterieller Substanzen ist sehr mühsam und schwer, was dazu führt, dass kaum neue Substanzen in den Pipelines sind [2]. Zwischen 1962 und dem Jahr 2000 wurden keine neue Antibiotikaklassen auf den Markt gebracht, obwohl immer mehr resistente Keime aufkamen [3]. Die größte Herausforderung ist es jedoch neue Antibiotika gegen Gram-negative Bakterien zu finden und zu entwickeln. Neben der Cytoplasmamembran besitzen diese eine zweite Barriere, die äußere Membran. Viele Wirkstoffe, die gegen Gram-positive Keime wirken, sind inaktiv gegen Gram-negative Bakterien. Bei vielen dieser Wirkstoffe ist dies darauf zurück zu führen, dass die Substanzen nicht in der Lage sind, die äußere Membran zu überwinden [2]. Diese alarmierenden Fakten heben hervor, wie dringend und groß der Bedarf an neuen und innovativen Wirkstoffen ist, die sowohl gegen Gram-positive als auch gegen Gram-negative Bakterien wirken. Eine vielversprechende Substanz, in diesem Zusammenhang, ist das Pseudopeptid Negamycin. Es wurde erstmalig aus dem Kulturfiltrat eines Streptomyceten isoliert, der dem Stamm Streptomyces purpeofuscus sehr ähnlich ist [4]. Es zeigt sowohl gegen Gram-positive als auch gegen Gram-negative Bakterien, zum Beispiel Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus, bakterizide Aktivität [4]. Hieraus lässt sich schließen, dass Negamycin in der Lage ist die äußere Membran und die Cytoplasmamembran zu überwinden. Für die Substanz wurde eine geringe Toxizität und vielversprechende pharmakokinetische Eigenschaften beschrieben [4, 5], was sie zu einem interessanten Kandidaten für eine mögliche, therapeutische Anwendung macht. Negamycin hemmt die Protein-Biosynthese, indem es zum einen die Ribosomen-Translokation inhibiert und zum anderen „miscoding“ verursacht [6-11]. Über die Aufnahme dieser hydrophilen und geladenen Substanz in die Zelle war jedoch zu Beginn dieser Doktorarbeit nur wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es den Aufnahmemechanismus von Negamycin zu untersuchen, und Erkenntnisse darüber zu gewinnen, welche Eigenschaften eine Substanz besitzen muss, um effizient in Gram-negative Bakterien zu gelangen. Aus den gewonnen Ergebnissen und Erkenntnissen konnte ein Negamycin-Aufnahme Modell erstellt werden. Ein Großteil der Aufnahmestudien wurde in dem Modellorganismus Escherichia coli durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von Negamycin in die bakterielle Zelle sehr komplex ist. Negamycin nutzt verschiedene Wege um in die Zelle zu gelangen, was das Risiko der Entstehung von Hochresistenz durch Mutation eines einzelnen Transporters minimiert. Die geringe Resistenzrate konnte dies bestätigen. Die Penetration der äußeren Membran kann durch verschiedene Wege erfolgen. Zum einen nutzt Negamycin Porine um über die äußere Membran zu gelangen. Die Aufnahme über Porine erfolgt hauptsächlich über OmpN, ein Porin für das bisher noch keine Beteiligung an Antibiotika-Aufnahme beschrieben wurde [12]. Zum anderen scheint Negamycin auch über einen Self-promoted-Uptake, und über passive Diffusion, über die äußere Membran zu gelangen. Um die zweite Barriere, die Cytoplasmamembran, zu überqueren, nutzt Negamycin verschiedene Routen. In Peptid-freiem Medium ist der Haupttransportweg die Dipeptid Permease Dpp. Auch beobachteten wir bei Deletionsmutanten des Protonen-abhängigen Peptidtransporters YbgH eine verringerte Negamycin Aufnahme. Negamycin gelingt es jedoch sogar in Abwesenheit von Dpp und in Peptid-haltigen Medien, in dem die Nahrungspeptide mit Negamycin um die Aufnahme an Peptidtransportern konkurrieren, in die Zelle zu gelangen. Dies weißt darauf hin, dass Negamycin noch mindestens eine weitere Aufnahmeroute, neben den Peptidtransportern, nutzen kann. Es konnte gezeigt werden, dass die Medien-Bedingungen einen großen Einfluss auf die Negamycin-Aktivität haben. In Standard-Testmedien konnte immer nur eine moderate Wirkung gemessen werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Zugabe von Ca2+ die Negamycin-Aktivität stark verbessert. Negamycin und Ca2+ formen einen Komplex, was zu einer gesteigerten Interaktion mit negativ geladenen Phospholipiden führt. Des Weiteren ist die Wirkung bei pH 8.5 deutlich besser als bei neutralem pH. Zum einen wird eine Aminoglykosid-ähnliche Aufnahme vermutet, bei der der Proton motive force (pmf) die treibende Kraft ist, und zum anderen eine passive Aufnahme. Circa 72% der Negamycin-Moleküle liegen bei diesem pH als Zwitterion vor. Zu einem geringen Teil liegt diese Spezies ungeladen vor, was eine passive Aufnahme der Substanz erleichtern kann. Die Kombination beider förderlichen Bedingung, die Zugabe von Ca2+ und pH 8.5, führte zu einer 32-fachen Wirkungssteigerung in E. coli, und auch in den pathogenen Problemkeimen P. aeruginosa und S. aureus konnte unter diesen Bedingungen eine Minimale Hemmkonzentration von 4 μg/ml gemessen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die antibakterielle Potenz von Negamycin unter Standard-Testbedingungen deutlich unterschätzt wird und dass insbesondere für intrazellulär wirkende Antibiotika gegen Gram-negative Bakterien ein Verständnis des Aufnahme-Mechanismus unabdingbar ist, um eine Substanz zielgerichtet optimieren zu können. Infectious diseases and the increase of antibiotic resistant strains are one of the main health issues we are facing today. In fact infectious diseases are the sixth major cause of death in Europe [1], and this is aggravated by the fact that discovery and development of novel antibiotics face many challenges and pipelines are empty [2]. Accordingly, between 1962 and 2000 no new antibiotic classes were introduced into the market [3]. The discovery and development of new antibiotics against Gram-negative bacteria is particularly problematic. They carry, besides the cytoplasmic membrane, an additional barrier, the outer-membrane. Consequently, antibiotics active against Gram-positive bacteria are often inactive against Gram-negative bacteria, due to their incapacity of penetrating this additional barrier [2]. In this context the discovery of new antibiotics, active against Gram-positive and Gram-negative bacteria, with new modes of action is an urgent therapeutic need. A promising antibacterial compound is negamycin, a pseudopeptide that was first obtained from culture filtrates of Streptomyces strains, closely related to Streptomyces purpeofuscus [4]. Negamycin is active against Gram-positive and Gram-negative bacteria including Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus [4], implying that negamycin is able to cross both penetration barriers, the outer membrane and the cytoplasmic membrane. Furthermore it showed low toxicity and promising pharmacokinetic properties [4, 5], which makes it interesting for therapeutic purposes. Negamycin was shown to target protein biosynthesis, by inhibiting ribosome translocation, polysome stabilization and miscoding [6-13]. However, the mechanism of uptake of this hydrophilic, positively charged compound into bacterial cells was scarcely investigated at the start of this PhD project. The aim of this work was to study the uptake of negamycin and to learn from nature the characteristics that render an antibiotic able to pass both the outer and the cytoplasmic membrane. On the basis of results of this work, a negamycin-uptake model was established. Entry-studies, performed in the model organism E. coli, demonstrated that the uptake of negamycin into the bacterial cell is very complex, and that the antibiotic enters the cell, using different uptake routes. This reduces the risk of developing high-level resistance by mutating a single transporter, as confirmed by a very low resistance rate for negamycin. The uptake across the outer membrane occurs mainly via a porin-mediated. It was shown that negamycin can pass the first barrier by using the porin OmpN, a minor porin that was never described as a route for antibiotic-uptake before [14]. The second barrier, the cytoplasmic membrane, negamycin can cross via multiple routes. The dipeptide permease Dpp was identified as the main entry route in peptide-free medium. Furthermore, reduced negamycin uptake was observed in knock-out mutants of the proton-dependent peptide transporter YbgH. The antibacterial activity of negamycin depends strongly on the culture medium and in standard media only moderate activity was described for negamycin. In this work, the presence of Ca2+ was demonstrated to strongly improve the activity of negamycin against both Gram-negative and Gram-positive bacteria. Furthermore, it was shown that Ca2+ forms a complex with negamycin and facilitates the interaction with negatively charged phospholipids. The antibacterial activity is also improved at basic pH. An aminoglycoside-like-uptake might be possible. The driving force would be the pmf. The combination of both beneficial conditions, namely the presence of Ca2+ and pH 8.5, resulted in a 32-fold improvement of sensitivity in E. coli and led to a minimal inhibitory concentration in the pathogens P. aeruginosa and S. aureus of 4 μg/ml. These findings show that the antibacterial potency of negamycin is strongly underestimated, when tested under standard MIC assay conditions. The present study also shows that for an antibiotic that acts in the cytoplasm of Gram-negative bacteria understanding the uptake mechanism is crucial towards a rational approach of structure optimization.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	09.03.2017
Dateien geändert am:	09.03.2017
Promotionsantrag am:	18.12.2015
Datum der Promotion:	11.02.2016