Dokument: Konstruktion und Analyse einer full length cDNA-Bank des humanen Cytomegalovirus und deren Anwendung zur Identifikation von IFN Antagonisten

Titel:	Konstruktion und Analyse einer full length cDNA-Bank des humanen Cytomegalovirus und deren Anwendung zur Identifikation von IFN Antagonisten
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=35685
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150923-130105-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Maywald, Marco [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,92 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.09.2015 / geändert 23.09.2015
Beitragende:	Prof. Dr. med. Hengel, Hartmut [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die IFN-γ induzierte Signalkaskade beruht auf der Integrität des Jak/STAT Signalwegs. Das humane Cytomegalovirus (HCMV) unterbindet die IFN-γ Signaltransduktion durch vielfältige redundante Mechanismen, die eine Degradation von Jak1, die Dephosphorylierung von STAT1 und die Stilllegung STAT1 abhängiger Promotoren umfassen. Diese redundanten Inhibitionsmechanismen verdeutlichen vor dem Hintergrund des ungewöhnlich umfangreichen HCMV-Kodierungspotentials von mehr als 700 open reading frames (ORFs) die Notwendigkeit neuer Screening-Ansätze zur Identifikation der verantwortlichen HCMV kodierten Genprodukte innerhalb einer viralen cDNA-Bank. Zur Herstellung einer HCMV cDNA-Bank wurden 5´-Cap bindende Antikörper eingesetzt, um auf full length cDNAs zu selektionieren und komplette kodierende Sequenzen von langen polycistronischen Transkripten sicherzustellen. Dadurch liefert die cDNA-Bank ein repräsentatives Abbild des HCMV Transkriptoms und beinhaltet auch Transkripte geringer Abundanz, die in bisherigen cDNA-Banken fehlen. Die Anwesenheit von Transkripten, die ausschließlich für neu identifizierte ORFs kodieren, und viele Transkripte mit neu identifizierten ORFs an der 5´-nächstgelegenen Position bestätigen eine erweiterte Kodierungskapazität des HCMV Genoms. Zuvor unbeschriebene potentielle ORFs und antisense Transkripte deuten eine bisher nicht erfasste Komplexität der HCMV Genexpression an. Im Gegensatz zum hohen Kodierungspotential ist die Zahl der Polyadenylierungssignale im HCMV Genom limitiert. Deshalb ist die Nutzung eines Polyadenylierungssignal zur Terminierung unterschiedlicher mRNAs eine weitverbreitete Eigenschaft in diversen Genregionen. Infolgedessen tragen 81% aller mRNAs die genetische Information für mehrere ORFs. Eine stabile Expression der HCMV cDNA-Bank nach lentiviraler Transduktion erlaubt ein funktionelles Screening nach potentiellen IFN-γ Antagonisten in aufeinanderfolgenden Sortierungsrunden im FACS. Das MHC Klasse II Molekül HLA-DR dient hierbei als stark induzierbarer FACS-Marker des IFN-γ Signalwegs. Als proof of principle konnte ein STAT1 degradierender Modell-Antagonist der IFN-γ Signaltransduktion, das Sendaivirus C-Protein, im FACS-Screening aufgereinigt werden. Folglich eignet sich das Screening-Prinzip, um Transkripte der cDNA-Bank zu identifizieren, die für virale IFN-γ Antagonisten kodieren. Das Screening der transduzierten HCMV cDNA-Bank führte zur Identifikation von Stathmin-1 als einen neuen potentiellen Regulator des IFN Signalwegs. IFN-γ induced signaling relies on the integrity of the Jak/STAT pathway. Human cytomegalovirus (HCMV) is able to counteract IFN-γ signaling by multiple redundant mechanisms including Jak1 degradation, STAT1 dephosphorylation and repression of STAT1-dependent promoters. The redundant inhibition of IFN-γ signaling accompanied by a recently reported enhanced coding capacity of HCMV comprising more than 700 open reading frames (ORFs) demonstrate the need for a comprehensive and improved screening approach to identify the responsible HCMV encoded gene products within a viral cDNA library. In order to generate a HCMV cDNA library, 5´-cap-antibodies were used to select for full length cDNAs ensuring complete coding sequences even of large polycistronic transcripts. The generated cDNA library provides a representative image of the HCMV transcriptome including low-abundance transcripts which were absent from previous conventional cDNA libraries. Transcripts encoding exclusively for newly identified ORFs and many transcripts with newly identified ORFs at the most 5´-position confirmed the extended coding potential of the HCMV genome. Previously unrecognized potential ORFs and antisense transcripts indicated further levels of HCMV genetic complexity. In contrast to the very high coding potential the number of polyadenylation sites in the HCMV genome is surprisingly limited. The usage of the same polyadenylation signal to terminate different mRNAs is a common feature in various gene regions. Altogether 81% of all mRNAs carry the genetic information for more than one ORF. Stable HCMV cDNA library expression by transduction of lentiviral vectors allowed a screening and enrichment of potential IFN-γ antagonists in successive sorting steps by FACS. MHC class II gene HLA-DR was chosen as a highly inducible FACS-marker of IFN-γ signaling. As a proof of principle a STAT1-degrading model IFN antagonist, the Sendai virus C protein, was purified by FACS-screening. This screening principle is utilized to identify cDNA library transcripts encoding for viral IFN-γ antagonists. FACS-screening of the transduced HCMV cDNA library identified Stathmin-1 as a potential new regulator of IFN signaling.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Virologie
Dokument erstellt am:	23.09.2015
Dateien geändert am:	23.09.2015
Promotionsantrag am:	29.05.2015
Datum der Promotion:	09.07.2015