Dokument: Entwicklung antiviraler Strategien am Beispiel der HIV-1 Reversen Transkriptase

Titel:	Entwicklung antiviraler Strategien am Beispiel der HIV-1 Reversen Transkriptase
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3452
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20101130-101506-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Grohmann, Dina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,68 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Riesner, Detlev [Gutachter] Prof. Dr. Goody, Roger S. [Gutachter]
Stichwörter:	HIV-1, Reverse Transkriptase, Nucleocapsid, Inhibitor, Peptide, small molecules, Aptamere
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Die Reverse Transkriptase (RT) des HIV-1 Virus stellt ein attraktives Zielprotein in der HIV-Therapie dar, da eine Hemmung des Enzyms den viralen Replikationszyklus in sehr frühen Stadien unterbricht. Der Einsatz von momentan verfügbaren RT-Inhibitoren in der medikamentösen Behandlung führt jedoch schnell zur Selektion von resistenten Virusstämmen. Die HIV-1 Reverse Transkriptase ist ein Heterodimer, das aus den Untereinheiten (UE) p66 und p51 besteht. Aufgrund der Korrelation zwischen Dimergehalt und Aktivität der RT ist die Interaktion der beiden Untereinheiten ein interessanter Angriffspunkt zur Inhibitorentwicklung. Über Mutationsstudien konnten die Aminsoäuren Lysin 331 und Asparagin 363 in der p51 UE identifiziert werden, die einen entscheidenden Beitrag zur Dimerstabilität leisten. Ein Aminosäureaustausch an diesen Positionen führte zu einer stark reduzierten Dimerbildung und infolgedessen zu einer verringerten Polymeraseaktivität. Kristallstrukturanalysen zeigten, dass Lysin 331 und Asparagin 363 wahrscheinlich mit den Tryptophanen (W) an Position 401, 402 und 410 in der p66 UE interagieren. Eine Blockade dieser Wechselwirkung führt voraussichtlich zu einer verminderten Dimerstabilität. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die chemische Bibliothek ASINEX nach niedermolekularen organischen Molekülen durchmustert, die mit hoher Wahrscheinlichkeit an W402 und W410 binden. Zwei der aus dem Selektionsprozess hervorgegangenen Substanzen, MAS 0 und MAS 1, konnten in dieser Arbeit als Dimerisierungsinhibitoren charakterisiert werden. Zusätzlich reduzierte MAS 0 unter den gewählten Bedingungen die Polymeraseaktivität der RT um ca. 70%. In dieser Arbeit konnten somit erstmals niedermolekulare Dimerisierungsinhibitoren für die HIV-1 RT beschrieben werden, die interessante Leitstrukturen für die Medikamentenentwicklung darstellen. Zusätzlich wurde überprüft, ob Nukleinsäuren und Peptide die Wechselwirkung der Untereinheiten blockieren können. Die Nukleinsäuren entstammten einer in vitro Selektion, in der die monomere p51 UE als Zielprotein eingesetzt wurde. Die untersuchten Aptamere übten jedoch weder einen Einfluss auf die Dimerisierung noch die enzymatische Aktivität der RT aus. Gleiches galt für verschiedene Peptidfamilien, die von den Grenzflächen der p66 und p51 UE abgeleitet wurden. In dieser Arbeit wurden darüber hinaus Inhibitionsexperimente mit klinisch relevanten RT-Mutanten, die eine Resistenz gegenüber nukleosidischen Inhibitoren (NRTI) aufweisen, durchgeführt. Das DNA-Aptamer RT1t49 und die Pseudoknoten-RNA reduzierten mit einem IC50 im unteren nanomolaren Bereich effektiv sowohl die enzymatischen Aktivitäten des RT-Wildtyps als auch die Aktivitäten von NRTI-resistenten RT-Mutanten. Nukleinsäuren, die wie die RT1t49 und die Pseudoknoten-RNA die Bindungsfurche der RT besetzen und dadurch das natürliche Substrat verdrängen, kommen somit als potente antivirale Wirkstoffklasse in der Behandlung von NRTI-resistenten HIV-Stämmen in Frage. Ein weiterer Ansatz umfasste mechanistische Untersuchungen zum Einfluss des viralen Nucleocapsid-Proteins auf die Polymeraseaktivität der RT. Über Nukleotideinbaustudien konnte nachgewiesen werden, dass bei einem molaren Verhältnis von NC zu Nukleotid von 1:1-2:1 der Nukleotideinbau stimuliert wird. Zeitaufgelöste fluoreszenzspektroskopische Messungen zeigten, dass dieser Effekt auf eine NC-vermittelte, reduzierte Dissoziationsgeschwindigkeit der RT-Nukleinsäure-Komplexe zurückzuführen ist. Für den Prozess der reversen Transkription innerhalb der Zelle ist daher anzunehmen, dass durch die NC-vermittelte Stabilisierung des binären Komplexes im Nukleoproteinkomplex eine höhere Prozessivität an stabilen Sekundärstrukturelemente erreicht werden kann. Diese mechanistischen Untersuchungen zeigen eine weitere und neuartige Möglichkeit der Inhibition auf: die Blockade der NC-RT-Interaktion, die vermutlich eine ineffiziente reverse Transkription zur Folge hätte.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	09.07.2006
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	06.07.2006
Datum der Promotion:	06.07.2006