Dokument: Engineering and characterization of a binder to inhibit in vivo α-synuclein aggregation

Titel:	Engineering and characterization of a binder to inhibit in vivo α-synuclein aggregation
Weiterer Titel:	Engineering and characterization of a binder to inhibit in vivo α-synuclein aggregation
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33938
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150413-132245-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Gauhar, Aziz [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 51,32 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.03.2015 / geändert 30.03.2015
Beitragende:	Dr. Hoyer, Wolfgang [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	α-Synuclein ist ein neuronales Protein, das vorwiegend in der Umgebung von Vesikeln in den präsynaptischen Nervenenden lokalisiert ist. Die genaue Funktion von α-Synuclein ist zwar wenig bekannt, dennoch ist das Protein an der Pathogenese der Parkinson-Krankheit und weiterer Synucleinopathien beteiligt. Fehlfaltung und Aggregation von α-Synuclein, die der Entstehung der löslichen Oligomeren und fibrillären Ablagerungen zugrunde liegen, werden durch aberrante Ereignissen, einschließlich bestimmter Mutationen und Polymorphismen der SNCA-Gen, hervorgerufen. Deshalb könnte die Stabilisierung von α-Synuclein, die zur Verhinderung der Selbsassoziation des Proteins führen soll, als Ansatzpunkt für die Arzneimittelentwicklung dienen. β-Wrapine sind kleine Bindepoteine, die aus kombinatorischen Proteinbibliotheken basierend auf ZAβ3 selektiert werden. Das β-Wrapin AS69 weist eine hohe Bindungsspezifität für α-Synuclein auf und inhibiert dessen Aggregation durch Beschlagnahmung der hydrophoben β-Haarnadel-Region, die sich bei der Bindung bildet. AS69 ist ein Homodimer, in dem die einzelnen Untereinheiten über eine Disulfidbrücke zwischen den Cys-28-Resten kovalent verknüpft sind. Diese Arbeit befasst sich mit der Herstellung einer Einzelketten-Version von AS69, in der die Untereinheiten in einem Head-to-Tail Format durch einen Linker verknüpft sind. Die Ergebnisse zeigen dass die Wahl eines geeigneten Linkers für die Erhaltung der Bindung von AS69 an α-Synuclein unerlässlich ist. Ein Vergleich mehrerer Konstrukte zeigt Eignung eines Glycin-Serin-reichen flexiblen Linkers. Der Einbau der Linker-Sequenz ergibt das AS69-GS3 Einzelketten-Homodimer, das mit dem ausschließlich Disulfid-gebundenen AS69 funktionale Parität aufweist. AS69-GS3 wurde unter oxidierenden und reduzierenden Bedingungen charakterisiert, um die Auswirkungen der Cys28-Disulfidbindung auf die Struktur, Stabilität und Bindung an α-Synuclein zu beurteilen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Bildung der Disulfidbindung zu einer Kompaktierung des Fusionsproteins führt, dessen Thermostabilität erhöht, und für Hochaffine Bindung unerlässlich ist. Darüber hinaus trägt die Linkersequenz zu einer erhöhten Stabilität des Konstrukts bei und fördert α-Synuclein-Bindung durch beschleunigte Ausbildung der Disulfidbrücke. Angesichts der Anfälligkeit der Disulfidbindung gegenüber reduzierenden Bedingungen, stellt das AS69-GS3 ein geeignetes Konstrukt für die in vivo Anwendung dar. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung der Auswirkung der β-Wrapine auf die durch α-Synuclein induzierte Toxizität in einem Zellkulturmodell. Hier wird der MTT-Toxizitättest eingesetzt um die Viabilität humaner SH-SY5Y-Neuroblastomzellen zu bestimmen. Ergebnisse zeigen, dass bei stöchiometrischen Konzentrationen von AS69-GS3 die Zellviabilität vollständig gerettet wird, während sie bei substöchiometrischen Konzentrationen deutlich verbessert wird. Das β-Wrapin AS10 ist ebenso effektiv bei der Hemmung der Aggregation und Zytotoxizität von α-Synuclein. Darüberhinaus inhibiert AS10 auch die Aggregation und Zytotoxizität des Amyloid-β Peptids und des Insel-Amyloid-Polypeptids. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass die Stabilisierung der monomeren α-Synuclein eine umsetzbare Strategie zur Verhinderung der Aggregation und Pathogenese der Parkinson-Krankheit und anderer Synucleinopathien darstellt. α-Synuclein is a neuronal protein that is predominantly localized around the vesicles in the presynaptic terminals. Although its exact function is not well known, the protein is implicated in the pathogenesis of Parkinson’s disease and other related disorders collectively known as synucleinopathies. Misfolding and aggregation of α-synuclein caused by aberrant events, including certain mutations and polymorphisms of the SNCA gene, result in the generation of toxic soluble oligomers and fibrillar deposits. Therefore inhibiting or reversing α-synuclein self-assembly could constitute a key approach for therapeutic intervention. The β-wrapins are engineered binding proteins selected from combinatorial libraries generated via random mutagenesis from the ZAβ3 scaffold. The β-wrapin AS69 specifically binds α-synuclein and inhibits its aggregation by sequestering the hydrophobic β-hairpin region that forms concomitant to binding. AS69 occurs as a homodimer where the individual subunits are connected through a disulfide bridge. This work investigates the possibility of creating a single-chain version of AS69 through head-to-tail linkage of its subunits. Findings of this work highlight the importance of suitable linker choice for preserving functional binding of AS69 to α-synuclein. Comparison of several constructs revealed the glycine-serine rich flexible linker as an appropriate choice. Incorporation of the linker sequence yields the AS69-GS3 single-chain homodimer that exhibits affinity equivalence with the solely disulfide linked AS69. The AS69-GS3 construct is characterized under oxidizing and reducing conditions to evaluate the impact of the Cys28-disulfide bond on structure, stability and α-synuclein binding. Results show that formation of the disulfide bond causes compaction of the fusion protein, increases its thermostability, and is essential for high affinity binding to occur. Moreover, the linker sequence further contributes to increased stability of the construct and promotes α-synuclein binding by affording accelerated disulfide bond formation. Considering the susceptibility of the disulfide bond to reducing conditions, AS69-GS3 represents a viable construct for in vivo application. The second part of this work addresses the potential of β-wrapins in blocking or mitigating α-synuclein-induced toxicity in a cell culture model. The MTT assay is employed to evaluate viability of human SH-SY5Y neuroblastoma cell line. Results demonstrate that cell viability is thoroughly rescued at stoichiometric concentrations of AS69-GS3, while at substoichiometric concentrations viability is significantly improved. Likewise, the β-wrapin AS10 is equally effective in inhibiting aggregation and cytotoxicity of not only α-synuclein, but also that of Amyloid-β and Insel-Amyloid-Polypeptide. Findings of this work suggest that stabilization of monomeric α-synuclein represents a workable strategy in preventing aggregation and pathogenesis of PD and other synucleinopathies.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	13.04.2015
Dateien geändert am:	13.04.2015
Promotionsantrag am:	16.02.2015
Datum der Promotion:	24.03.2015