Dokument: Neue Naturstoffe aus endophytischen Pilzen und einem Bodenpilz – Chemische und biologische Charakterisierung

Titel:	Neue Naturstoffe aus endophytischen Pilzen und einem Bodenpilz – Chemische und biologische Charakterisierung
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=33247
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20150127-113740-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hammerschmidt, Lena [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 24,61 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.01.2015 / geändert 27.01.2015
Beitragende:	Prof. Dr. Proksch Peter [Gutachter] Prof. Dr. Kassack, Matthias U. [Gutachter]
Stichwörter:	Endophytische Pilze, Naturprodukte, Sekundärmetabolite, Isolierung, NMR
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die Zahl an Resistenzen gegenüber antibiotischen und zytotoxischen Arzneimitteln steigt kontinuierlich. Daher ist die Gewinnung neuer und wirksamer Substanzen von großem Interesse. Endophytische Pilze und Bodenpilze haben die Fähigkeit, eine Vielzahl chemisch diverser Metabolite zu bilden. Da sich ihre Metabolite durch unterschiedliche pharmakologische Wirkungen auszeichnen, ist ihre Erforschung und Kultivierung von großem Interesse. Das pilzliche Potenzial ist weiterhin eine vielversprechende Quelle neuer, wirksamer Arzneistoffe. Neuste Ansätze, wie die gezielte Veränderung von Kultivierungsbedingungen, verfolgen die Strategie, kryptische Biosynthesecluster zu aktivieren, um sowohl die Metabolitmenge zu erhöhen als auch die Synthese neuer Verbindungen zu induzieren. Das Ziel dieser Arbeit war die Isolierung, Strukturaufklärung und Bioaktivitätstestung sekundärer Metabolite aus Pilzen. Im Rahmen dessen wurden Endophyten aus verschiedenen pflanzlichen Geweben isoliert, sowie ein Bodenpilz aus einer Bodenprobe gewonnen und unter Standardbedingungen kultiviert. Anschließend wurden diese Kulturen mit Ethylacetat extrahiert und die Extrakte mittels verschiedener chromatografischer Methoden fraktioniert und aufgereinigt. Die Reinsubstanzen wurden daraufhin basierend auf ihren HPLC, LCESIMS, UV und 1D und 2D NMR spektroskopischen Eigenschaften und stereochemisch mittels optischer Rotationsdispersion, Mosher-Ester-Analyse, Marfey-Reaktion und Circulardichroismus aufgeklärt. Insgesamt konnten 33 Reinsubstanzen gewonnen und aufgeklärt werden. Davon stellten 12 neue Substanzen dar. Antibiotische und zytotoxische Aktivitäten wurden mittels standardisierter Testsysteme untersucht. In der vorliegenden Dissertation werden die in wissenschaftlichen Fachjournalen veröffentlichten oder zur Publikation eingereichten Ergebnisse in Form der jeweiligen Manuskripte dargestellt: Penicillium glabrum Der endophytische Pilz Penicillium glabrum wurde aus der Granatapfelsfrucht (Punica granatum, Lythraceae), der in Usbekistan gesammelt wurde, isoliert. Der Pilzextrakt, auf Reis kultiviert, lieferte neben zwei neuen Styrylpyronen, 3-Methyldesmethoxyyangonin und 3-Methylbisnoryangonin, noch vier bekannte Substanzen. Die Strukturen der isolierten Metabolite wurden mittels 1D und 2D NMR und Massenspektrometrie aufgeklärt. Acremonium strictum Fünf neue Polyketide, 6`-Hydroxypestalotiopson C, Acropyron, Bicytosporon D, Waolsäure und Pestalotiopen C wurden zusammen mit sieben bekannten aus dem Extrakt des endophytischen Pilzes Acremonium strictum, der aus der lang gestelzten Mangroven Rhizophora apiculata (Rhizophoraceae) isoliert wurde, gewonnen. Die Strukturen der isolierten Substanzen wurden auf Basis von vergleichender NMR- und MS-Analysen aufgeklärt. Die Substanzen Waol A, Pestalotiopen A und Cytosporon E zeigten moderate zytotoxische Aktivität gegenüber der humanen Cisplatin-sensitiven (IC50-Werte von 27,7, 76,2 und 8,3 µM) und der resistenten A2780-Zelllinie (IC50-Werte von 12,6, 30,1 und 19,0 µM), wohingegen nur Cytosporon E auch antibakterielle Aktivität gegenüber Staphylococcus aureus (MHK-Wert von 14.3 µM) aufwies. Xylaria sp. Der endophytische Pilz Xylaria sp. wurde aus den gesunden Blättern der Gelbwurz Curcuma xanthorrhiza (Zingiberaceae) isoliert, die auf der Insel Timor, Indonesien gesammelt wurde. Zwei neue Substanzen Arugosin J und Xylarugosin wurden zusammen mit dem bekannten Resacetophenon isoliert und strukturell durch umfassende NMR- und massenspektrometrische Analysen aufgeklärt. Die Enantiomere von rac-Arugosin J wurden mittels chiraler HPLC getrennt und ihre HPLC-ECD-Spektren wurden, um die absolute Konfiguration auf Basis von TDDFT-ECD-Kalkulationen zu bestimmen, aufgenommen. Die absolute Konfiguration des optisch aktiven Xylarugosins konnte durch den Vergleich des experimentellen, in Lösung aufgenommenen ECD-Spektrums mit den TDDFT-Spektren, der in Gasphase und Lösung berechneten Konformere, als (3R,3aR,9aR) ermittelt werden. Gymnascella dankaliensis Der Bodenpilz Gymnascella dankaliensis wurde in der Umgebung der Gizeh-Pyramiden in Ägypten gesammelt. Der Pilz auf Reismedium kultiviert, erbrachte vier neue Substanzen (11`-carboxygymnastatin N, Gymnastatin S, Dankamid und Aranorosin-2-methylether). Über letztere wurde vorher nur als semisynthetische Substanz berichtet. Zusätzlich wurden noch sechs weitere Substanzen isoliert. Die Zugabe von NaCl oder KBr zum Reismedium resultierte in der Akkumulation von chlorierten oder bromierten Metaboliten, was durch LC-MS-Analyse aufgrund der charakteristischen Isotopenmuster gezeigt werden konnte. Aus dem mit 3,5 % NaCl versehenen Reismedium wurden Gymnastatin A und Gymnastatin B isoliert. Alle isolierten Substanzen wurden eindeutig strukturell sowohl basierend auf umfassenden 1D und 2D NMR spektroskopischen und Massen spektrometrischen Analysen, als auch durch Literaturvergleiche aufgeklärt. Aranorosin-2-methylether, Aranorosin und Gymnastatin A zeigten gute Zytotoxizität gegenüber der murinen Lymphomzelllinie L5178Y mit IC50-Werten von 0,44, 0,58 bzw. 0,64 µM, wohingegen Gymnastatin B moderate Aktivität mit einem IC50-Wert von 5,80 µM aufwies. The number of resistances towards the antibiotic and cytotoxic drugs used nowadays increases continuously. Therefore, the exploitation of new and effective substances is of high benefit. Endophytic and soil derived fungi have already proved to be a promising source of new and potentially bioactive natural products due to their high variety of secondary metabolites. The investigation and cultivation of these fungi is of great interest since their metabolites have shown high potential for different pharmacological effects. Recent approaches like the selective change of cultivation conditions pursue the strategy to activate cryptic biosynthesis clusters both to increase the amount of constitutively present compounds and to induce the synthesis of new metabolites. The scope of this thesis was the isolation, structure elucidation and the analysis of the bioactivity of secondary metabolites from fungi. In this context endophytic fungi were isolated from different plant tissues and one fungus was derived from a soil sample. Each of these was cultivated under standardized conditions. Afterwards, the cultures were extracted with ethyl acetate and the extracts were fractionized and purified using different chromatographic methods. The pure compounds were elucidated based on HPLC, LCESIMS, UV and 1D and 2D NMR spectroscopic properties as well as stereochemically elucidated with the help of optical rotation, Mosher ester analysis, Marfey’s reaction and circular dichroism. In total 33 purified compounds could be isolated and structurally elucidated. Twelve new natural products were gained. Antibacterial and cytotoxic activities were analyzed using standardized assays. In this dissertation the results published in or submitted to scientific journals are presented as the manuscripts: Penicillium glabrum The endophytic fungus Penicillium glabrum was isolated from pomegranate fruits (Punica granatum, Lythraceae) collected in Uzbekistan. Extracts of the fungus grown on rice yielded two new styrylpyrones, namely 3-methyldesmethoxyyangonin and 3 methylbisnoryangonin, together with four known metabolites. The structures of the isolated compounds were elucidated on the basis of comprehensive spectral analysis (1D and 2D NMR and MS). Acremonium strictum Five new polyketide derivatives, 6`-hydroxypestalotiopsone C, acropyrone, bicytosporone D, waol acid, and pestalotiopene C, together with seven known metabolites, were obtained from extracts of the endophytic fungus Acremonium strictum, isolated from the tall-stilt mangrove (Rhizophora apiculata, Rhizophoraceae). The structures of the isolated compounds were elucidated on the basis of comprehensive NMR and MS analysis. Compounds waol A, pestalotiopene A and cytosporone E showed moderate cytotoxic activity against human cisplatin-sensitive (IC50 values 27.1, 76.2, and 8.3 µM, respectively) and resistant A2780 cell lines (IC50 values 12.6, 30.1, and 19.0 µM, respectively). Furthermore, only cytosporone E exhibited antibacterial activity against Staphylococcus aureus (MIC value 14.3 µM). Xylaria sp. The endophytic fungus Xylaria sp. was isolated from healthy leaves of the javanic turmeric (Curcuma xanthorrhiza, Zingiberaceae), collected on the island of Timor, Indonesia. Two new compounds arugosin J and xylarugosin, together with the known resacetophenone, were isolated and their structures were elucidated on the basis of comprehensive NMR and mass spectral analysis. The enantiomers of rac-arugosin J were separated by chiral HPLC and their HPLC-ECD spectra were recorded to determine the absolute configuration on the basis of TDDFT-ECD calculations. The (3R,3aR,9aR) absolute configuration of the optically active xylarugosin was established by comparing the experimental solution ECD spectrum with the TDDFT ones computed for the gas phase and solution (PCM solvent model) conformers. Gymnascella dankaliensis The soil fungus Gymnascella dankaliensis was collected in the vicinity of the Giza pyramids, Egypt. When grown on solid rice medium the fungus yielded four new compounds including 11`-carboxygymnastatin N, gymnastatin S, dankamide, and aranorosin-2-methylether, the latter having been reported previously only as a semisynthetic compound. In addition, six known metabolites were isolated. Addition of NaCl or KBr to the rice medium resulted in the accumulation of chlorinated or brominated compounds as indicated by LC-MS analysis due to the characteristic isotope patterns observed. From the rice medium spiked with 3.5 % NaCl the known chlorinated compounds gymnastatin A and gymnastatin B were obtained. All isolated compounds were unambiguously structurally elucidated on the basis of comprehensive spectral analysis (1D and 2D NMR, and mass spectrometry), as well as by comparison with the literature. Compounds aranorosin-2-methylether, aranorosin and gymnastatin A showed potent cytotoxicity against the murine lymphoma cell line L5178Y (IC50 values 0.44, 0.58 and 0.64 µM, respectively), whereas gymnastatin B exhibited moderate activity with an IC50 value of 5.80 µM.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Dokument erstellt am:	27.01.2015
Dateien geändert am:	27.01.2015
Promotionsantrag am:	10.11.2014
Datum der Promotion:	14.01.2015