Dokument: Tat translocase composition in Corynebacterium glutamicum and the effect of TorD coexpression

Titel:	Tat translocase composition in Corynebacterium glutamicum and the effect of TorD coexpression
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=32768
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20141204-102417-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Oertel, Dan [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 12,43 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.11.2014 / geändert 27.11.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Roland Freudl [Gutachter] Prof. Dr. Joachim Ernst [Gutachter]
Stichwörter:	Mikrobiologie, Biotechnologie
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der twin-arginine translocation (Tat)-Weg erlaubt die Translokation vollständig gefalteter, Kofaktor-haltiger und oligomerisierter Proteine über die zytoplasmatische Membran von Bakterien und die Thylakoidmembran von Pflanzenchloroplasten. In Gram-negativen Bakterien wie Escherichia coli und Pflanzenchloroplasten wird eine ABC-Typ Translokase verwendet die aus drei Komponenten besteht (TatA, TatB und TatC) welche distinkte Funktionen erfüllen. TatA Multimere bilden die eigentliche Translokationspore und TatB und TatC zusammen einen Rezeptorkomplex, der für die Erkennung des Signalpeptides des Tat-Substrates verantwortlich ist. In den meisten niedrig G/C-haltigen Gram-positiven Bakterien existiert eine AC-Typ Translokase, in der ein bifunktio- nales TatA Molekül sowohl im Rezeptorkomplex in der Signalpeptid Erkennung wirkt als auch den Transloka- tionkanal über die Membran bilden kann. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der biotechnologisch wichtige, hoch G/C-haltige, Gram-positive Mod- ellorganismus Corynebacterium glutamicum eine Translokase des ABC-Typs für seine Tat-abhängige Transloka- tion verwendet. Dies wurde durch die notwendige Beteiligung von C. glutamicum TatB bei der Translokation von Modell Tat-Substraten gezeigt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Membraneinbau des C. glutam- icum Rieske Proteins QcrA, einer Eisen-Schwefel-Cluster haltigen Komponente des Cytochrom bc1 Komplexes der Hauptatmungskette, Tat-abhängig erfolgt. Unter aeroben Wachstumsbedingungen führt die Deletion des tat- AC Operons oder des monocistronisch lokalisierten tatB zu einer vergleichbaren Wachstumsinhibierung, was auf die gleichwertige Wichtigkeit der drei Tat-Komponente hinweist. Dadurch, dass eine C. glutamicum qcrA- Mutante, nicht aber eine qcrA/tatB Doppelmutante mit QcrA in trans komplementiert werden kann, konnte gezeigt werden, dass TatB für die Assemblierung dieses wichtigen Tat-Substrates zwingend notwendig ist. Desweitern wurde gezeigt, dass C. glutamicum TatBC.g. ein bona fide TatB ist, da es für TatB-Funktion in einer E. coli tatB-Mutante, aber nicht für TatA-Funktion in einer tatA-Mutante komplementieren kann. In der ABC- Typ Translokase von E. coli erfüllt TatB eine dezidierte Funktion als essentielle Komponente des Rezeptorkom- plex, welche klar von der Translokationskanal-bildenden Funktion von TatA differenziert werden kann. Dieser Befund demonstriert, dass TatBC.g. nicht bifunktional ist, und ist eine weitere Bestätigung dafür, dass C. glutam- icum und höchstwahrscheinlich alle Actinobacterien eine ABC-Typ Translokase, wie in Gram-negativen Bakte- rien, verwenden. Es wurde berichtet, dass Koexpression des E. coli Redoxenzym Reifungsprotein (REMP) TorD den Export het- erologer Substrate mit dem Signalpeptid der TMAO Reduktase TorA, durch Schutz vor intrazellulärer Proteol- yse, verbessern kann. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Expression von TorD in C. glutamicum oder in einem E. coli tatB-Mutantenstamm der C. glutamicum TatB exprimiert, zu einem vollständigen Exportblock von TorASP-Substraten führt. Dieser Befund führte zu der Hypothese, dass die Ablösung des Chaperons TorD vom TorASP-Substrat einen aktiven Mechanismus in Form einer Interaktion zwischen TatB und dem TorD/TorASP- Substratkomplex benötigt und diese Funktion (falls existent) in Anwesenheit von C. glutamicum TatB nicht stat- tfindet. Basierend auf dieser Annahme wurde eine mögliche aktive Beteiligung von TatB am TorD-Ablöse- prozess untersucht. Unerwarteterweise und im Widerspruch zu der ursprünglichen Hypothese, konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von TatB für eine Ablösung von TorD vom TorASP-Substratkomplex nicht zwin- gend notwendig ist was darauf hinweist, dass es keinen aktiven Ablösemechanismus gibt, der eine Interaktion mit der Tat Translokase voraussetzt. Vielmehr scheinen sowohl die Quantität und/oder die Qualität von TatB einen indirekten Einfluss darauf zu haben wie gut TorASP-Substrate in Anwesenheit von TorD exportiert werden. Die Analyse von, E. coli/ C.glutamicum-hybrid TatB Proteinen enthaltenden, Tat Translokasen wiesen auf eine Wechselbeziehung zwischen Translokaseeffizienz und Export von TorASP-Substraten in Anwesenheit von TorD hin. Dies deutet darauf hin, dass eine kinetische Partitionierung freier TorASP-Substrate zwischen Bindung an TorD und Transfer zur Signalpeptid-Bindetasche des TatBC Rezeptorkomplexes letztendlich darüber entscheidet wie viel TorASP-Substrat, bei gegebener Menge des TorD Chaperons, über die Membran transloziert werden kann. The twin-arginine translocation (Tat) pathway facilitates the translocation of fully folded, co-factor associated, or even oligomerized proteins across the cytoplasmic membrane of bacteria and the thylakoid membrane of plant chloroplasts. In Gram-negative bacteria such as Escherichia coli and plant chloroplasts, an ABC-type translocase is found in which three different translocase components (TatA, TatB and TatC) perform distinct functions. Whereas oligomers of TatA constitute the actual protein conducting channel, the components TatB and TatC together form a receptor complex which is responsible for recognizing the signal peptides of the Tat- substrates. In most low-G/C Gram-positive bacteria on the other hand, an AC-type translocase is found in which a bifunctional TatA component can both partake in signal peptide recognition in the receptor complex as well as in the formation of the protein conducting channel across the membrane. In this work, it could be shown that in the biotechnologically important high-G/C Gram-positive model organ- ism Corynebacterium glutamicum a translocase of the ABC-type is used as the functional unit for Tat-dependent translocation. This was achieved by showing the involvement of C. glutamicum TatB in the translocation of model Tat-substrates. Furthermore, it could be demonstrated that the C. glutamicum Rieske protein QcrA, a component of the cytochrome bc1 complex of the main respiratory chain which contains an iron-sulfur cluster, is integrated into the cytoplasmic membrane in a Tat-dependent manner. Under aerobic growth conditions, the deletion of either the tatAC operon or the monocistronically localized tatB gene results in a comparable growth inhibition, showing the equal importance of all three Tat components. By demonstrating that a C. glutamicum qcrA mutant but not a qcrA/tatB double mutant can be complemented with QcrA in trans it was proven that TatB presence is absolutely essential for the assembly of this important Tat substrate. Finally, it was shown that C. glutamicum TatBC.g. is a bona fide TatB as it can complement for TatB function in an E. coli tatB-mutant strain, but not for TatA function in a tatA-mutant strain. Since in the ABC-type Tat-translocase of E. coli, TatB fulfills a dedicated role as an essential component of the receptor complex which is clearly different from the translocation-pore function of TatA, this finding demonstrated that TatBC.g. is not bifunctional and further con- firmed that C. glutamicum, and most likely other Actinobacteria as well, utilize a Gram-negative style, ABC- type Tat-translocase. Coexpression of the E. coli redox enzyme maturation protein TorD has been reported as an option to increase Tat-dependent export of heterologous substrates bearing the signal peptide of the TMAO reductase TorA through protection from intracellular proteolysis. However, in this work it was found that when TorD was ex- pressed in C. glutamicum or in an E. coli tatB-mutant strain expressing C. glutamicum TatB, this resulted in a complete export block of TorASP-substrates. These findings led to the hypothesis that the release of the TorD chaperone from the TorASP-substrate might be actively triggered by an interaction between TatB and the TorD/ TorASP-substrate complex and that this function of TatB (if existent) might be precluded by the presence of the foreign C. glutamicum TatB. Based on this hypothesis, a possible active involvement of TatB in TorD release was investigated. Surprisingly and in contrast to the original hypothesis, it was found that the presence of TatB is not strictly required for the release of TorD from the TorD/TorASP-substrate complex, suggesting that in fact no active release mechanism involving an interaction with the Tat translocase exists. Rather, both the quantity and/or nature of TatB seem to have an indirect influence on how well export of TorASP-substrates in the presence of TorD can take place. The analysis of Tat translocases containing hybrid E. coli/ C. glutamicum TatB proteins revealed an interrelationship between translocase efficiency and export of TorASP-containing substrates in the presence of TorD, strongly suggesting that a kinetic partitioning of free TorASP-substrate between (re)binding to TorD and transfer to the signal peptide-binding pocket in the TatBC receptor complex ultimately determines how much TorASP-substrate can actually be translocated across the membrane in the presence of given concen- trations of the TorD chaperone.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	04.12.2014
Dateien geändert am:	04.12.2014
Promotionsantrag am:	22.08.2014
Datum der Promotion:	18.09.2014