Dokument: Molecular biological and spectroscopic characterisation of the [NiFe]-hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris

Titel:	Molecular biological and spectroscopic characterisation of the [NiFe]-hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3165
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20050715-001165-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Goenka Agrawal, Aruna [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,61 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Gärtner, W. [Gutachter] Prof. Dr. Westhoff, Peter [Gutachter] Prof. Dr. Holzwarth, Alfred R. [Gutachter]
Stichwörter:	hydrogenase, molekular biologie, spectroscopy, Deletionsmutante, nickel, biochemie, electrochemie, minimal medium, gene sequencing, 61Ni, 15N HisHydrogenase, molecular biology, spectroscopy, deletion mutant, gene sequencing, nickel, defined medium, chelex resin, electrochemistry, biochemistry, 61Ni, 15N His
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Molekularer Wasserstoff ist ein hoffnungsvoller zukünftiger Energieträger. [NiFe]-hydrogenasen sind Metallo-Enzyme, die die reversible Umwandlung von molekularem Wasserstoff katalysieren. Das hetero-bimetallische Zentrum mit einem Nickel- und einem Eisenatom stellt das essentielle Strukturelement in dieser Reaktion dar. Kristallographische Untersuchungen haben die atomaren Details dieses katalytischen Zentrums aufgezeigt, allerdings ist der exakte Reaktionsmechanismus noch immer nicht in allen Einzelheiten verstanden. Als gesichert gilt, dass mehrere unterschiedliche Redox-Zustände durchlaufen werden. Das Eisenatom ist diamagnetisch und daher „EPR-inactiv“. Allerdings trägt es mehrere anorganische Liganden (CO und CN), so dass seine Beteiligung an der Umwandlung des Wasserstoffs mittels FTIR-Spektroskopie verfolgt werden kann. In einigen Zuständen des Enzyms ist das Nickelatom paramagnetisch, so dass EPR-Techniken angewandt werden können. Neben den Schwierigkeiten Seim Verständnis der Struktur und der Funktion des Enzyms stellt sich auch der Biosyntheseweg des aktiven Zentrums in dem eine Reihe von Maturierungsproteinen involviert sind als ungewöhnlich komplex dar. Diese sind sehr spezifisch in ihrer Aktivität und eine genaue Kenntnis ihrer Funktion ist essentiell für die Erzeugung rekombinanter Hydrogenasen. In dieser Arbeit wurden die Gene, deren Genprodukte in der Maturierung der [NiFe]-Hydrogenase der nah verwandten Schwefel-reduzierenden Bakterien Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F (DvMF) und D. vulgaris Hildenborough (DvH) beteiligt sind, untersucht und Methoden entwickelt, genetisch veränderte Hydrogenasen zu erzeugen. Neben der Behandlung der Reifung der Hydrogenase wurde die Struktur des activen zentrums mittels Isotopen-markierten Proteinen untersucht. Dazu wurden die Protokolle zur Herstellüng der verschiedenen Redox-Zustände optimiert, so dass die einzelnen Formen mit spektroskopischen Methoden untersuchtn werden konnten. Das Operon der [NiFe]-Hydrogenase von DvMF wurde charakterisiert, wobei man nachweisen konnte, dass dieses große Operon einen s54-typischen Promotor trägt. Den Strukturgenen nachfolgend konnte die Präsenz von Genen nachgewiesen werden, die für Maturierungsproteine kodieren. Die Endopeptidase (C-Untereinheit) wurde bezüglich ihrer möglichen Sekundär- und Tertiärstruktur genauer analysiert. Die identifizierten Maturierungsproteine wurden außerdem im Hinblick auf ihre Verwandtschaft mit anderen Organismen verglichen. Die Möglichkeit zur Darstellung genetisch modifizierter Hydrogenasen wurde durch die Herstellung einer Deletionsmutante von DvH eröffnet. Die Auswirkungen dieser Deletion bezüglich der Wachstumseigenschaften waren nahezu unbedeutend. Aus Analysen von Gel-Funktions assays kann geschlossen werden, dass in DvMF wahrscheinlich nur line Hydrogenase vorhanden ist. Deren Deletion Könnte sich als letal für den Organismus erweisen und somit die Schwierigkeiten bei der Herstelung eine Deletionsmutante von DvMF erklären. Fur weitere spektroskopische Arbeiten wurde ein synthetisches Medium entwickelt, das den Einbau stabiler Isotope erlaubte. Eine Reinigung über Chelex (Ionenaustauscher) erlaubte die Entfernung des natürlich vorkommenden Nickels und ermöglichte die Supplementation mit der optimalen Konzentration an 61Ni. Eine durchgeführte ELDOR-NMR Messung dieser Probe erlaubte die Untersuchung der direkten Umgebung des Nickels in beiden oxidierten Ni-A und Ni-B Zuständen, aus denen man ableiten konnte, dass der zentrale, überbrückende Ligand in diesen beiden Zuständen gleich sein sollte. In einem ähnlichen Ansatz konnte mittels 15N markiert Histidin die Stärke einer Wasserstoffbrücke zwischen Histidin-88 und dem nah gelegenen Cystein-549 nachgewiesen werden, die an dem „fine tuning“ der elektronischen Struktur des aktiven Zentrums beteiligt ist. Durch diese Dissertation gelang es, die Kenntnis über die Struktur des aktiven Zentrums der [NiFe]-Hydrogenase aus DvMF auf molekularbiologischen und auch auf spektroskopischem Niveau deutlich voranzubringen. Weiterhin werden weitere Möglichkeiten zur Darstellung genetisch modifizierter Hydrogenasen eröffnet. Molecular hydrogen is a potential energy carrier for the future. [NiFe] hydrogenases are metalloenzymes, which catalyse the reversible conversion of molecular hydrogen. The hetero-bimetallic catalytic centre with a nickel and an iron atom is the essential structural element in this reaction. Crystallographic studies have revealed the atomic details of the active site, however, the exact reaction mechanism is not yet known, though different redox states are involved. The iron atom is diamagnetic, and thus EPR silent. However, it possesses inorganic ligands, CO and CN, that allow to follow the conversion of the various states by FTIR spectroscopy. In some of the redox states nickel is paramagnetic, which permits the use of EPR techniques. Besides the nature of the active site, its biological assembly is also not completely understood. The synthesis and installation of this NiFe(CN)2CO catalytic centre is a complex process in which a whole set of auxiliary proteins are involved. These so-called maturation proteins are very specific in their action on the target complex, and a knowledge of their function is essential for the generation of recombinant hydrogenases. In this thesis, genes involved in the maturation of the [NiFe] hydrogenase of the closely related sulfur reducing bacteria, Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F (DvMF) and Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH) were examined, and the possibility of employing genetically modified hydrogenase for hydrogen production has been investigated. Together with the maturation of the hydrogenase, the structure of the active site was investigated using the isotopically labeled protein. Protocols for the preparation of different redox states of the [NiFe] hydrogenase from DvMF were optimised and the states thus prepared were subjected to advanced spectroscopy techniques. The operon sequence of the DvMF [NiFe] hydrogenase was characterised, and was found to be a long operon with a s54-type promoter present upstream and maturation genes present downstream of the structural genes. The endopeptidase (C-subunit) was further investigated for its possible secondary and tertiary structure. Also, the complete set of maturation genes for DvH [NiFe] hydrogenase was analysed for its function as compared to known maturation genes from other organisms. The potential for producing a genetically modified hydrogenase was investigated by generating and studying a mutant strain of DvH, lacking the [NiFe] hydrogenase. The effect of deletion of the hydrogenase gene on its growth behavior in standard medium was found to be almost insignificant. The difficulties in generating the deletion for DvMF were traced by looking for other, if any, hydrogenases present in the strain by comparing the gel activity assays and electrochemical behaviour of all the species studied in this thesis. These assays give evidence that DvMF probably has only one hydrogenase which would cause its deletion a lethal process for the organism. A synthetic medium was designed for the growth of DvMF, to achieve the isotope labeling in hydrogenase. Chelex cleaning was used to remove any natural abundant nickel and allowed to add the optimum concentration of 61Ni to the medium. Determination of the 61Ni hyperfine coupling constants by ELDOR detected NMR allowed us to investigate the direct environment of Ni in both the oxidized Ni-A and Ni-B states, and it was found that Ni-A and Ni-B have a bridging ligand of similar nature. Similarly, the natural abundance of 14N in His residues was replaced by using 15N-His in the growth medium in a separate culture growth experiment. This allowed the determination of the H-bond strength between His-88 and Cys-549 of the active [NiFe] centre. It could be demonstrated that this H-bond contributes to finetune the electronic structure of the active site. This thesis advances the knowledge about the structure of the active site of DvMF [NiFe] hydrogenase on a molecular-biological and a spectroscopic level and opens possibilities for further development of the genetically modified hydrogenases.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	15.07.2005
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	11.07.2005
Datum der Promotion:	11.07.2005