Dokument: Charakterisierung Testosteron-bindender Proteine in RAW 264.7 Makrophagen

Titel:	Charakterisierung Testosteron-bindender Proteine in RAW 264.7 Makrophagen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3162
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20050714-001162-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Tillmanns, Nadine [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,86 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Wunderlich, Frank [Gutachter] Prof. Dr. Mehlhorn, Hans-Peter Heinz [Gutachter]
Stichwörter:	Testosteron, Makrophagen, mAR, Androgenrezeptor, nicht-genomisch
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Das Steroidhormon Testosteron kann seine Wirkung über zwei verschiedene Mechanismen entfalten: Über die Aktivierung des genomischen Wegs durch den klassischen intrazellulären Androgenrezeptor oder durch schnelle, nicht-genomische Wirkung über einen noch nicht näher charakterisierten membranständigen Androgenrezeptor (mAR). Ziel der vorliegenden Arbeit war die Isolation und Charakterisierung des membranständigen Androgenrezptors bzw. die Identifizierung von spezifisch Testosteron-bindenden Proteinen, die für die Initiierung der nicht-genomischen Effekte in den RAW 264.7 Makrophagen verantwortlich sind. In allen Experimenten wurde die murine Makrophagenzelllinie RAW 264.7 verwendet, die keinen klassischen Androgenrezeptor exprimiert, wie mittels RT-PCR nachgewiesen wurde. Trotz des fehlenden iAR konnten am Konfokalen Laserscanning Mikroskop (CLSM) nach Inkubation der Makrophagen mit einem Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Testosteron-BSA-Konjugat (Te-BSA-FITC), spezifische Bindungsstellen auf der Zelloberfläche detektiert werden. Zur Isolierung des mAR wurden verschiedene Methoden eingesetzt. Als erstes wurde eine Lambda-Phagenbank mit 4,6 Millionen unabhängigen Klonen konstruiert, um Phagen zu isolieren, die ein spezifisch Testosteron-bindendes Protein exprimieren. Trotz der großen Zahl an Primärklonen konnte aus dieser Bank kein Phage isoliert werden, der reproduzierbar ein Te-BSA-FITC-bindendes Protein exprimiert hätte. Zweitens wurde versucht, die bei der Internalisierung der Te-BSA-FITC-mAR-Komplexe entstehenden Vesikel mit Hilfe des MACS-Systems anzureichern und die darin befindlichen Proteine über SDS-PAGE zu analysieren. Dazu wurden zunächst Te-BSA-FITC und anti-FITC-Microbeads komplexiert und die RAW 264.7 Zellen nach erfolgreicher Internalisierung der Microbeads lysiert. Die Vesikel sollten dann im magnetischen Feld aufgereinigt werden. Durch die Internalisierung wurde jedoch unter Umständen die magnetische Kraft der verwendeten Beads soweit abgeschwächt, dass keine Fixierung an der Säulenmatrix erfolgte. Laut Hersteller ist es außerdem möglich, dass die Microbeads in den Vesikeln aufgrund der dort herrschenden enzymatischen Bedingungen zersetzt wurden. Als drittes wurden Zellen mit radioaktivem Methionin/Cystein metabolisch markiert und mit Te-BSA-Konjugat inkubiert. Nach Bindung des Liganden an den mAR wurde die Bindung kovalent über einen ‘Crosslinker’ fixiert, die Zellen lysiert und mit anti-BSA-Agarose inkubiert. Die so angereicherten Proteine wurden über SDS-PAGE aufgetrennt. Es zeigte sich jedoch, dass – egal unter welchen Bedingungen – stets zahlreiche verschiedene Proteine präzipitiert wurden. Viertens erfolgte die Identifizierung Testosteron-bindender Proteine aus RAW 264.7 Zellen mittels ‘Overlay’. Dabei konnte reproduzierbar eine etwa 35 kDa große Bande in der löslichen Proteinfraktion nachgewiesen werden. Um die Identität dieses Proteins zu bestimmen, wurden eine 2D-Analyse und eine anschließende massenspektrometrische Analyse durchgeführt. Dabei konnten die Enzyme Laktatdehydrogenase (LDH) und Aldolase sowie das GTP-bindende Protein Ran eindeutig identifiziert werden. Mittels eines in vitro Enzymtests wurde eine konzentrationsabhängige Suppression der LDH Aktivität durch Testosteron festgestellt. Eine solche direkte Testosteron-LDH Wechselwirkung legt die Möglichkeit nah, dass es sich beim mAR nicht um einen klassischen heptahelikalen G-Protein-gekoppelten Rezeptor handelt, sondern dass eine Subfraktion der LDH auch an der Plasmamembran lokalisiert ist, hier Testosteron bindet und nicht-genomische Signalwege initiiert.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	14.07.2005
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	12.07.2005
Datum der Promotion:	12.07.2005