Dokument: Spektroskopische und elektrochemische Untersuchung der [NiFe]-Hydrogenase aus Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F

Titel:	Spektroskopische und elektrochemische Untersuchung der [NiFe]-Hydrogenase aus Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3143
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20050704-001143-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Fichtner, Caroline [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 18,77 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Lubitz, Wolfgang [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Stichwörter:	Wasserstoff, [NiFe]-Hydrogenase, Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F, FTIR-Spektroskopie, EPR-Spektroskopie, Elektrochemie, Reaktionsmechanismus, enzymatische Wasserstoffspaltunghydrogen, [NiFe] hydrogenase, Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F, FTIR spectroscopy, EPR spectroscopy, electrochemistry, reaction mechanism, enzymatic hydrogen cleavage
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die [NiFe]-Hydrogenase aus Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F gehört zu einer Gruppe strukturell sehr ähnlicher [NiFe]-Hydrogenasen, die die reversible Oxidation von molekularem Wasserstoff katalysieren und damit bei der Energiegewinnung der Zelle eine wichtige Rolle spielen. Das Interesse der Forschung konzentriert sich auf die Aufklärung des Reaktionsmechanismus, um dieses Wissen auf die biotechnologische Gewinnung von Wasserstoff als alternativen Energieträger übertragen zu können. Das katalytisch aktive Zentrum der Hydrogenase besteht aus einem heterobimetallischen [NiFe]-Cluster, der während des Reaktionsablaufes verschiedene Redoxzustände einnimmt, die sich in vitro elektrochemisch einstellen lassen. Da für die in vitro-Studien an der [NiFe]-Hydrogenase hochreines Protein in einer hohen Konzentration benötigt wurde, war die Etablierung einer effizienten Isolierung aus der bakteriellen Zelle und Methoden zur Charakterisierung der Enzymaktivität notwendig. Durch proteinfilmvoltammetrische Experimente konnte gezeigt werden, daß die [NiFe]-Hydrogenase ein im Vergleich zu anderen Standardhydrogenasen stark sauerstoffempfindliches Enzym ist und eine anaerobe Inaktivierung nur nach Zugabe von Na2SO3 möglich ist, was zur Hypothese führte, daß im inaktiven, oxidierten Zustand "Ni-A'' ein Sulfoxid im aktiven Zentrum gebunden ist. Die verschiedenen Redoxzustände unterscheiden sich desweiteren in ihren Absorptionseigenschaften des infraroten Lichtes. Erstmalig konnten die charakteristischen Absorptionsbanden dieser Hydrogenase im Infrarot-Bereich zwischen 1900 cm-1 und 2200 cm-1 identifiziert und den einzelnen Redoxzuständen zugeordnet werden. Dies beantwortet zweifelsfrei die Frage nach der Identität der drei zweiatomigen Liganden im aktiven Zentrum, bei denen es sich um ein CO- und zwei CN-Moleküle handelt. Die pH-Wert-abhängigen, spektroelektrochemischen Experimente zeigten darüber hinaus, daß jeder Redoxübergang mit einer Protonierung gekoppelt ist. Die Untersuchung der wellenlängenabhängigen Photokonversion des reduzierten, aktiven Zustandes "Ni-C'' in den lichtinduzierten Zustand "Ni-L'' mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie zeigte durch den Vergleich mit UV/VIS-spektroskopischen Messungen, daß die beteiligten Übergänge Ligand-zu-Metall-Ladungstransfer-Charakter besitzen, und ermöglichte die Beschreibung des Prozesses anhand eines Modells. Die Schlußfolgerungen sind zur Annahme konsistent, daß im Zustand Ni-C die Substratbindestelle mit einem Hydrid (H-) besetzt ist. Die Ergebnisse der Experimente erlaubten Rückschlüsse auf die Eigenschaften der Redoxzustände, so daß hieraus ein Reaktionsmechanismus postuliert werden konnte. The [NiFe] hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F belongs to group of structurally very similar [NiFe] hydrogenases which catalyze the reversible oxidation of molecular hydrogen and therefore play an important role in the energy metabolism of the cell. The interest of research on hydrogenases is concentrated on the elucidation of the reaction mechanism to transfer the gained knowledge onto the biotechnological hydrogen production for the use of hydrogen as alternative energy source. The catalytically active site of the hydrogenase consists of a heterobimetallic [NiFe] cluster taking up different redox states during the reaction course which can be achieved in vitro by an electrochemical approach. Due to the fact that for in vitro studies a lot of highly purified protein material in high concentration is needed the establishing of an efficient isolation process of the protein from the bacterial cell as well as methods for quantification of the enzymatic activity were necessary. Protein film voltammetric experiments revealed that the examined [NiFe] hydrogenase is highly sensitive to oxygen compared to other [NiFe] hydrogenases. Furthermore, an anaerobic inactivation was only possible in the presence of Na2SO3 leading to the hypothesis that a sulfoxide molecule is bound to the active site in the inactive, oxidized state “Ni-A”. Moreover, the redox states differ in their absorption characteristics of infrared light. For the first time the characteristic absorption bands of the [NiFe] hydrogenase in the spectral region of 1900 cm-1 to 2200 cm-1 were identified and assigned to the different redox states. This gives a doubtless answer to the question of the identity of the three diatomic ligands of the active site bound to an iron atom which are one CO and two CN- molecules. The pH dependent spectroelectrochemical experiments indicate furthermore that each redox transition is coupled to the transfer of one electron and one proton. The investigation of the wavelength dependent photoconversion of the reduced active state “Ni-C” into the light induced state “Ni-L” by electron paramagnetic resonance spectroscopy revealed by comparison with UV/VIS spectroscopic experiments that the involved transitions are ligand-to-metal charge-transfer transitions and enabled the description of the photoconversion process by means of a simple model. The conclusions are consistent with the assumption of a hydrid (H-) as bridging ligand in the Ni-C state. The results of all experiments allowed to draw conclusions concerning the properties of the redox states and the postulation of a possible reaction mechanism.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	04.07.2005
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	10.06.2005
Datum der Promotion:	10.06.2005