Dokument: Charakterisierung des Einflusses der zellulären Effektoren ppGpp und DksA auf das Initiationsverhalten von E. coli RNA-Polymerasen an stringent und nicht stringent regulierten Promotoren
| Titel: | Charakterisierung des Einflusses der zellulären Effektoren ppGpp und DksA auf das Initiationsverhalten von E. coli RNA-Polymerasen an stringent und nicht stringent regulierten Promotoren | |||||||
| Weiterer Titel: | Characterization of the influence of the cellular effectors ppGpp and DksA on E. coli RNA-polymerase initiation at stringent and non-stringent regulated promoters | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=31180 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20141023-110019-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Agyenim, Tommy [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | ppGpp, DksA, RNA Polymerase | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Unter natürlichen Bedingungen befinden sich Bakterien unentwegt unter Anpassungsdruck an die Umwelt. Die Anpassung auf Aminosäurenmangel geschieht über ein komplexes regulatorisches Netzwerk, welches Stringente Kontrolle genannt wird. Die auffälligsten Reaktionen dieser globalen Antwort sind die abrupte Inhibierung der Synthese stabiler rRNAs und tRNAs, sowie die Induktion der Aminosäurenbiosynthese inklusive des Aminosäurentransports. In Escherichia coli sind die Schlüsseleffektoren dieser Stringenten Kontrolle das Alarmon Guanosin-3´,
5′-bispyrophosphat (ppGpp) sowie das Protein DksA. Letzteres wurde erst einige Jahre nach der Entdeckung von ppGpp und seiner Bedeutung für die Stringente Kontrolle anhand divergierender Ergebnisse aus in vivo Analysen und DksA-freien in vitro Ansätzen als Modulator der Stringenten Kontrolle identifiziert. Die vorliegende Arbeit befasst sich in den ersten beiden Teilen mit grundlegenden Mechanismen der Regulation stringenter Promotoren. Hierbei lag das Augenmerk zum einen auf der Bedeutung der Startnukleotide für die ppGpp-Sensitivität ribosomaler rRNA P1-Promotoren und zum anderen auf der Bedeutung der RNA-Polymerase Untereinheit ω für die Regulation stringenter Promotoren. In in vitro Transkriptionsanalysen konnte gezeigt werden, dass die rRNA P1-Sensitivität auf ppGpp unter bestimmten Nukleotid-Bedingungen stark von der Startnukleotidsequenz der jeweiligen Promotoren abhängt. In diversen Analysen konnte bestätigt werden, dass die ω-Untereinheit der Escherichia coli RNA-Polymerase eine prominente Rolle in der ppGpp-vermittelten Regulation ribosomaler P1-Promotoren einnimmt. Dieses konnte durch DksA kompensiert werden. Die Regulation des hisG- und des tac-Promotors war, wie erwartet, in keiner der getesteten Bedingungen durch ω beeinflusst. Auch gelang es nicht, im Rahmen der durchgeführten Analysen der ω-Untereinheit eine Beteiligung an der Bildung des offenen binären Transkriptionskomplexes nachzuweisen, wie sie beispielsweise für die σ-Untereinheit der RNA-Polymerase bekannt ist. Der dritte Teil umspannt vergleichende Proteomanalysen, in denen mittels 2D-Elektrophoresen der Einfluss von DksA unter stringenten Bedingungen auf Proteinebene analysiert wurde. Hierzu wurde nach Auslösen der Stringenten Kontrolle Gesamtproteinextrakt, sowohl aus einem Escherichia coli ΔdksA- als auch aus einem WT-Stamm, isoliert. Bei der Auswertung der differentiell exprimierten Proteine wurde sich auf die Proteine konzentriert, deren veränderte Synthese aus dem Fehlen des DksA-Proteins während der Stringenten Kontrolle herrührt. MALDI-TOF-Analysen ergaben, dass dieses vorwiegend auf Proteine der Proteinbiosynthese zutraf. Weiterhin konnten Proteine des Kohlenhydratstoffwechsels, des Purin/Pyrimidinstoffwechsels, des DNA-Reparaturmecha-nismus und der Fettsäuren- bzw. Zellwandsynthese identifiziert werden, die ebenfalls obige Anforderungen erfüllten.Under natural circumstances bacteria are permanently exposed to environmental stress. Aminoacid starvation leads to an activation of a complex regulatory network named stringent response to compensate this limitations. One of the hallmarks of the stringent response is the rapid inhibition of stable RNA synthesis and the induction of aminoacid biosynthesis as well as aminoacid transportmechanism. In Escherichia coli this is mainly initiated by the function of the alarmone guanosine 3', 5'-bispyrophosphate (ppGpp) and the protein DksA. Many years after the discovery of ppGpp and its involvement in the stringent regulation, DksA was shown to be a modulator of stringent control due to discrepancies of in vivo analysis and DksA free in vitro studies. The first two parts of this study has been done to analyze the basic mechanism behind the regulation of stringent promoters. It has been focused on the involvement of the start nucleotides in the ppGpp dependent regulation of rRNA-P1 promoters as well as on the involvement of the ω subunit of the RNA-polymerase in the regulation of stringent controlled promoters. It has been shown by in vitro transcription analysis that the sensitivity of rRNA P1 to ppGpp under certain nucleotide conditions strongly depends on the start nucleotide sequence of the particular promoter. In different analysis of this study it has been confirmed that the ω-subunit in Escherichia coli RNA-polymerase is an important factor in regulation of ribosomal P1 promoters by ppGpp. This dependence of omega is compensated by the activity of DksA. As expected there was no impact of ω on the regulation of the hisG promoter and the tac promoter. It is important to say that this study fails to identify a participation of ω in the composition of the open binary complex as it is known for the σ-subunit of the RNA-polymerase for example. The third part of this study deals with comparative proteome analysis done by 2D-elektrophoresis to analyze the impact of DksA under situation of stringent control on protein level. After induction of the stringent control total protein extract of the wt and ΔdksA strains was isolated. Evaluation of the differential synthesized proteins was concentrated on those proteins whose synthesis was changed in situations of stringent control due to the deletion of DksA. MALDI-TOF analysis shows that these proteins mainly belong to proteins of the protein biosynthesis. Additionally, proteins of the carbonhydrate metabolism, the purine/pyrimidine metabolism, the DNA repair mechanism as well as the fatty acid metabolism and the cell wall synthesis were shown to be part of these DksA dependent proteins. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Molekularbiologie der Prokaryoten | |||||||
| Dokument erstellt am: | 23.10.2014 | |||||||
| Dateien geändert am: | 23.10.2014 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 10.03.2014 | |||||||
| Datum der Promotion: | 17.07.2014 |
