Dokument: Optimierung einer Lipase aus Bacillus subtilis mit neuen Methoden der gerichteten Evolution

Titel:	Optimierung einer Lipase aus Bacillus subtilis mit neuen Methoden der gerichteten Evolution
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3040
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20050208-001040-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Funke, Susanne Aileen [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,32 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter]
Stichwörter:	Bacillus subtilis, Lipase, Gerichtete Evolution, Enantioselektivität
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Die biokatalytische Produktion enantiomerenreiner Komponenten gewinnt sowohl für die chemische als auch für die pharmazeutische Industrie immer weiter an Bedeutung. Leider ist die Enantioselektivität von Enzymen gegenüber biotechnologisch interessanten Substraten häufig zu gering. Mit Hilfe der gerichteten Evolution, das heisst mit dem Einfügen von Mutationen in das entsprechende Gen und nachfolgendem Screening der entstandenen Proteinvarianten auf eine verbesserte Eigenschaft, kann ein Enzym an eine gewünschte Reaktion angepasst werden. Die Lipasen LipA (BSLA) und LipB (BSLB) aus B. subtilis sind aufgrund ihrer geringen Größe, des hohen pH-Optimums und des großen Substratspektrums biotechnologisch hochinteressante Enzyme. In dieser Arbeit wurden die Enzyme nach der chromatographischen Reinigung biochemisch näher charakerisiert. Durch die Anwendung von neuen Methoden zur gerichteten Evolution wurde die BSLA in ihrer Enantioselektivität optimiert. Dabei wurden Erkenntnisse über die Struktur-/Funktionsbeziehungen der BSLA im Hinblick auf die Enantioselektivität gewonnen. 1) Chromatographische Reinigung und biochemische Charakterisierung der BSLA und der BSLB Im ersten Teil der Arbeit wurden die BSLA und die BSLB nach ihrer chromatographischen Reinigung hinsichtlich ihrer Hydrolaseaktivität gegenüber verschiedenen industriell bedeutsamen und biologisch abbaubaren Polyestern untersucht. Dabei zeigten beide Enzyme hydrolytische Aktivität gegenüber Poly-(D,L-Lactid), einem Substrat, das, soweit bekannt, nur von wenigen Enzymen hydrolysiert werden kann. Des Weiteren konnten beide Enzyme durch die Inkubation in bestimmten ionischen Flüssigkeiten in ihrer lipolytischen Aktivität gesteigert werden. Die Versuchsergebnisse belegen das hohe biotechnologische Potential der Enzyme. 2) Gerichtete Evolution der BSLA Im zweiten Projekt wurde, als neuer Ansatz zur gerichteten Evolution enantioselektiver Lipasen, eine komplette Sättigungsmutagenese der BSLA durchgeführt, in der jede einzelne Aminosäure der BSLA gegen sämtliche 19 natürlichen Aminosäuren ausgetauscht wurde. Dabei entstand eine Bank von 3439 Enzymvarianten. 55.000 Klone (mehr als zehnfache Überabtastung) wurden auf veränderte Enantioselektivität bei der Hydrolyse von meso-1,4-Diacetoxy-2-cyclopenten geprüft. Dabei konnten verschiedene BSLA-Varianten identifiziert werden, die im Vergleich zum Wildtyp eine hohe umgekehrte Enantioselektivität bei der Hydrolyse des Substrats zeigten. Die Aminosäureposition 18 wurde als „hot-spot“-Position identifiziert. Alle Aminosäureaustausche an der Position Asn18 bewirkten eine Umkehrung der Enantioselektivität bei der Hydrolyse von meso-1,4-Diacetoxy-2-cyclopenten. Bei der biochemischen Charakterisierung zeigten die Varianten mit einem Aminosäureaustausch an der Position 18 im Vergleich zum BSLA-Wildtyp verringerte Umsätze und verringerte Thermostabilitäten. Asn 18 ist an exponierter Position in einer Aminosäure-Schleife in der Nähe der katalytischen Triade der BSLA lokalisiert und interagiert vermutlich direkt mit dem Modellsubstrat. In einem weiteren Screening der vollständigen Sättigungsmutagenese-Bank wurden Varianten entdeckt, die das (S)-Enantiomer von 1-(2-Naphthyl)ethylacetat hydrolysieren können, während der BSLA-Wildtyp enantioselektiv nur (R)- 1-(2-Naphthyl)ethylacetat mit einem E-Wert von über 100 spaltet. Ausschlaggebend für diese Veränderung der Enantioselektivität ist ein Aminosäureaustausch an Position 76 in unmittelbarer Nähe des katalytisch aktiven Ser77, der vermutlich zu einer Veränderung der Substratbindetasche führt. Mit zwei Screening-Ansätzen konnten wichtige Determinanten für die Enantioselektivität der BSLA gegenüber verschiedenen Substraten bestimmt werden. Dies bestätigte die Nützlichkeit und die universelle Anwendbarkeit einer vollständigen Sättigungsmutagenese-Bank. 3) Entwicklung einer neuen Methode zur in vitro Rekombination (Multiplex-PCR-based Recombination (MUPREC) Im dritten Teil der Arbeit wurden in ihrer Enantioselektivität verbesserte BSLA-Varianten untereinander sowie mit einer thermostabilen BSLA-Variante rekombiniert. Dazu wurde eine neue, einfache und effektive Methode zur in vitro Rekombination entwickelt. Mit dieser können Punktmutationen miteinander kombiniert werden, fast ohne dass zufällige Neumutationen in die entsprechenden Gene eingeführt wurden. Im Screening auf verbesserte Enantioselektivität bei der Hydrolyse von meso-1,4-Diacetoxy-2-cyclopenten konnte eine Variante mit zwei Aminosäurenaustauschen (N18Q; Y49V) identifiziert werden, die den gleichen umgekehrten ee-Wert von 82 %, aber auch eine höhere spezifische Aktivität zeigte als die beste BSLA-Variante mit einem einzelnen Aminosäureaustausch N18Q. Die Michaelis-Menten-Konstante der Doppelmutante ist im Vergleich zu der des Wildtyps und von N18Q erniedrigt.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	08.02.2005
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	27.01.2005
Datum der Promotion:	27.01.2005