Dokument: In vitro Analysen prokaryotischer Transkriptionsmechanismen während der exponentiellen und stationären Phase der Genexpression

Titel:	In vitro Analysen prokaryotischer Transkriptionsmechanismen während der exponentiellen und stationären Phase der Genexpression
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3035
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20050203-001035-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Reckendrees, Britta [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 26,29 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter] Prof. Dr. Bünemann, Hans [Gutachter]
Stichwörter:	E. coli, Transkriptionsregulation, RNA-Polymerase, Sigmafaktoren, rpoS-Regulon, Stringente Kontrolle, rrnB P1, bolA, ppGpp, KaliumglutamatE. coli, transcription regulation, RNA polymerase, sigmafactors, rpoS-regulon, stringent control, rrnB P1, bolA, ppGpp, potassium glutamate
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	In vivo sind Bakterien einer Vielzahl von Stresssituationen ausgesetzt. Eine spezifische Anpassung an die jeweiligen Wachstumsbedingungen ist dabei essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei prokaryotische Stressantworten, die Stringente Kontrolle und die generelle Stressantwort, näher charakterisiert. Unter der Stringenten Kontrolle versteht man die schnelle Antwort der Zelle auf Aminosäuremangel. Die auffälligste Reaktion ist die unmittelbare Inhibierung der stabilen RNA-Synthese. Darüber hinaus sind jedoch auch positiv stringent regulierte Gene bekannt. Die Regulation wird durch das Effektormolekül ppGpp vermittelt. Als weitere relevante Komponenten werden die DNA-abhängige RNA-Polymerase (RNAP) und die jeweiligen Promotoren angesehen. Ein notwendiges, aber nicht hinreichendes Promotorelement der positiven bzw. negativen Stringenten Kontrolle stellt die promotornahe Diskriminatorregion dar. Als Hauptregulationsstufe wird die Initiation der Transkription angesehen. Der entscheidende ppGpp-abhängige Schritt in diesem mehrphasigen Prozess wird jedoch kontrovers diskutiert. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit synthetisch konstruierten 'mismatch bubble' Templates die Rolle der zweiten Initiationsphase (offene Komplexbildung) sowie die Rolle der s-Untereinheit der RNAP und die Funktion der Diskriminatorregion im Rahmen der Stringenten Kontrolle analysiert. 'Mismatch bubble' Templates sind DNA-Fragmente, die über einen definierten Bereich permanent geöffnet sind, wodurch sie eine Transkriptionsblase nachahmen können. Neben der Untersuchung der ppGpp-abhängigen Transkription stand die Analyse der Spezifität der Erkennung der künstlichen Templates im Mittelpunkt. Dazu wurden detaillierte in vitro Untersuchungen an drei verschiedenen 'mismatch bubble' Templates mit Homologie zum rrnB P1 Promotor durchgeführt. In Verbindung mit früheren Analysen lassen die hier erzielten Ergebnisse folgende Schlussfolgerungen zu: - Die Erkennung der 'mismatch bubble' Templates durch die RNAP erfolgt in Abhängigkeit von der Promotorsequenz. Dabei ist die Spezifität der RNAP abhängig von der Größe und Lage des ungepaarten Bereichs. - Der entscheidende Schritt der ppGpp-vermittelten Inhibierung ist der Bildung des offenen Promotorkomplexes nachgeschaltet. Dies untermauert ein aktuelles Regulationsmodell, das von einer ppGpp-abhängigen Inhibierung der Bildung der ternärer Initiationskomplexe ausgeht. - Die s-Untereinheit und die Diskriminatorregion sind nicht zwingend notwendig für die negative stringente Regulation, können diese jedoch beeinflussen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Transkriptionsregulation während der generellen Stressantwort in E. coli, deren Hauptregulator die Sigma38-Untereinheit der RNAP ist (RpoS-Regulon). Sie beschreibt den Wechsel zwischen Sigma70- und Sigma38-abhängiger Transkription beim Übergang in die stationäre Wachstumsphase und bei verschiedenen Stresssituationen. Aufgrund der zellulären Konzentrationen beider s-Faktoren sowie deren unterschiedlichen Affinitäten zum Core-Enzym der RNAP und der geringen in vitro Promotorspezifität der beiden Holoenzyme, ist eine Sigma38-vermittelte Transkription ohne die Beteiligung weiterer Faktoren nicht vorstellbar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Modulation der Promotorspezifität durch folgende potenzielle Spezifitätsfaktoren untersucht: Superhelikalität, Kaliumglutamat und ppGpp. In detaillierten strukturellen und funktionellen in vitro Analysen an je einem Sigma70- bzw. Sigma38-abhängigen Promotor konnten für das Sigma70- und Sigma38-Holoenzym der RNAP folgende Ergebnisse ermittelt werden: - Eine Kreuzerkennung der untersuchten Promotoren durch beide Holoenzyme ist möglich. - Die Strukturen der RNAP-Promotorkomplexe der beiden Holoenzyme unterscheiden sich nur geringfügig. - Bei der Bildung der ternären Komplexe ist die notwendige Konzentration der Startnukleotide für den Sigma38-abhängigen Promotor geringer als für den Sigma70-abhängigen Promotor. - Die Spezifität der beiden Holoenzyme zeigt unterschiedliche Abhängigkeiten von der Superhelikalität des Promotors. - Neben Kaliumglutamat wird hier erstmals für ppGpp die Aktivierung eines Sigma38-abhängigen Promotors in einem in vitro Transkriptionssystem gezeigt.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	03.02.2005
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	14.12.2004
Datum der Promotion:	14.12.2004