Dokument: Regulation of the phosphate starvation response in Corynebacterium glutamicum by the PhoRS two-component system

Titel:	Regulation of the phosphate starvation response in Corynebacterium glutamicum by the PhoRS two-component system
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=3027
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20050131-001027-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kocan, Martina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,06 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Sahm, Hermann [Gutachter]
Stichwörter:	Phosphatmangel, Corynebacterium glutamicum, Zweikomponentensystem, PhoRS, PhoR, PhoSphosphate starvation, Corynebacterium glutamicum, two-component system, PhoRS, PhoR, PhoS
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Im 3.3 Mb-Genom des gram-positiven Bakteriums Corynebacterium glutamicum wurden Gene für 13 Zweikomponenten-Systeme identifiziert. Durch gerichtete Mutagenese wurde ein Satz von zwölf Mutanten konstruiert, in denen die Gene für jeweils eine Sensorkinase und den dazugehörigen Antwortregulator deletiert waren. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob eines der Zweikomponentensysteme von C. glutamicum an der Anpassung an Phosphatmangel beteiligt ist. Dazu wurden die genannten Mutanten unter Phosphatmangel und unter Phosphatüberschuss kultiviert. Eine der Mutanten wuchs bei Phosphatmangel, nicht aber bei Phosphatüberschuss, deutlich schlechter als der Wildtyp. Der Wachstumsdefekt konnte durch plasmid-gekoppelte Expression der fehlenden Gene komplementiert werden. Diese Resultate wiesen auf eine Funktion des fehlenden Zweikomponentensystems bei der Phosphatmangel-Antwort hin und die entsprechenden Gene wurden daher phoS (Phosphat-Sensorkinase) und phoR (Phosphat-Response-Regulator) genannt. Mit dem Ziel, die Gene zu identifizieren, die durch den Antwortregulator PhoR reguliert werden, wurden DNA-Microarray-Analysen durchgeführt. Das Transkriptom der phoRS-Mutante wurde vor und nach einem Wechsel von Phosphatüberschuss zu Phosphatmangel verglichen. Dabei zeigte sich, dass mit Ausnahme des pstSCAB-Operons die Gene, die im Wildtyp unter Phosphatmangel induziert werden (pstSCAB, ugpAEBC, glpQ, phoH, nucH und ushA), in der Mutante nicht induziert wurden. Dies erklärt die Wachstumshemmung der phoRS-Mutante unter Phosphatmangel. Die pstSCAB-Gene, die einen hochaffinen ABC-Tranporter für Phosphat kodieren, wurden in der phoRS-Mutante unter Phosphatmangelbedingungen noch partiell induziert, was auf die Existenz eines weiteren, bisher noch unbekannten Regulators der pst-Gene hindeutet. Durch Primer-Extension-Analysen der Gene pstS, ugpA und phoR wurden die DNA-Microarray-Daten bestätigt und die Transkriptionsstartpunkte bestimmt. Die genannten Resultate deuten darauf hin, daß PhoR als Aktivator vieler Phosphatmangel-Gene fungiert. Mit den isolierten Proteinen konnte die ATP-abhängige Autokinase-Aktivität von solubilisiertem PhoS und der Phosphoryltransfer von phosphoryliertem PhoS auf PhoR nachgewiesen werden. Die Bindung des Antwort-Regulators PhoR an die Promotorregionen der Operons pstSCAB, ugpAEBC und phoRS wurde durch Gelretardationsexperimente analysiert. Mit dem vollständigen PhoR-Protein konnte unabhängig von den gewählten Bedingungen keine Bindung gezeigt werden. Mit einem PhoR-Derivat, bei dem die aminoterminalen 125 Aminosäuren durch einen Hexahistidin-Tag ersetzt wurden, konnte dagegen eine Bindung an die vier oben genannten Promotorregionen nachgewiesen werden, nicht jedoch an die Promotorregionen von clpP1P2 und clpC, die als Negativkontrollen dienten. Zusätzlich wurde die PhoR-Bindestelle in der pstS-Promotorregion durch DNase-I-Footprint-Experimente analysiert. Dabei wurde der Bereich 170 bis 205 bp stromaufwärts des pstS-Transkriptionsstarts als geschützt identifiziert. Within the 3.3 Mb-genome of the gram-positive bacterium Corynebacterium glutamicum genes for 13 two-component systems were identified. By directed mutagenesis, a set of 12 strains was constructed each lacking the genes for one sensor kinase and its response regulator. In this work it was tested, whether one of the two-component systems of C. glutamicum is involved in the phosphate starvation response. To this end, the mutants mentioned above were cultivated under phosphate excess and phosphate limitation. One of the mutants grew poorer than the wild type under phosphate limitation, but not under phosphate excess. The growth defect could be abolished by expression of the missing genes from a plasmid. These results indicate a function of the deleted two-component system in the phosphate starvation response and therefore the corresponding genes were named phoS (phosphate sensor kinase) and phoR (phosphate response regulator). With the aim to identify the target genes of response regulator PhoR, DNA microarray analyses were performed. The transcriptom of the phoRS mutant before and after a shift from phosphate excess to phosphate starvation was compared. Genes known to be induced by phosphate starvation in the wild type (pstSCAB, ugpAEBC, glpQ, phoH, nucH and ushA), were not induced in the mutant, explaining the impaired growth of the phoRS mutant under phosphate limitation. The pstSCAB genes encoding a high-affinity ABC transporter for phosphate were still partially induced in the phoRS mutant under phosphate limitation, indicating the existence of an additional, currently unknown regulation of the pst operon. By primer extension analysis of pstS, ugpA and phoR, the DNA microarray data were confirmed and the transcriptional start sites of these genes were determined. In summary, the data indicated that the PhoS-PhoR two-component system is responsible for the activation of many phosphate starvation genes. Both the autokinase activity of solubilized PhoS and the phosphoryl transfer from phosphorylated PhoS to PhoR were demonstrated with the isolated proteins. The binding of the response regulator PhoR to the promoters of pstSCAB, ugpAEBC and phoRS was analysed by gel shift analyses. With the entire PhoR protein it was not possible to show binding, irrespective of the conditions applied. However, a derivative of PhoR in which the aminoterminal 125 amino acid residues were deleted and replaced by a histidine tag did bind to the four promoter regions mentioned above, but not to the negative control promoters clpP1P2 and clpC. Additionally, the PhoR binding site within the pst promoter was analysed by DNase I footprinting, which indicated a protected region localized 170 to 205 bps upstream of pstS transcriptional start site.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	31.01.2005
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	19.01.2005
Datum der Promotion:	19.01.2005