Dokument: Gewinnung von D-Mannitol mit rekombinanten Escherichia coli Stämmen

Titel:	Gewinnung von D-Mannitol mit rekombinanten Escherichia coli Stämmen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2974
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20041203-000974-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kaup, Björn-Arne [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,65 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Sahm, Hermann [Gutachter] Prof. Dr. Hollenberg, Cornelis P. [Gutachter]
Stichwörter:	E. coli, Ganzell-Biotransformation, D-Mannitol, Dehydrogenase, Formiat, Facilitator, D-Fruktose, D-Glukose, Leuconostoc, ZymomonasE. coli, whole-cell biotransformation, D-mannitol, D-fructose, D-glucose, mannitol dehydrogenase, formate dehydrogenase, glucose facilitator, Leuconostoc, Zymomonas
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Ziel dieser Arbeit war die Konstruktion eines rekombinanten Escherichia coli Stammes, der aus D-Fruktose bzw. D-Glukose D-Mannitol, ohne Nebenprodukte, bildet. Es wurde im ersten Schritt die NAD-abhängige Mannitol-2-Dehydrogenase des heterofermentativen Milchsäurebakteriums Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC 12291 in E. coli exprimiert. Trotz hoher Enzymaktivität war dieser E. coli Stamm nicht in der Lage, in Ganzzell-Biotransformationen D-Mannitol aus D-Fruktose zu bilden. Die Koexpression der NAD-abhängigen Formiat-Dehydrogenase des methylotrophen Mycobacterium vaccae N10 zur Kofaktor-Regeneration führte, trotz hoher Aktivitäten der beiden Enzyme, nur zur Bildung geringer Mengen D-Mannitol aus D-Fruktose und Formiat. Da E. coli normalerweise D-Fruktose über das Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase System aufnimmt, ist dieser Zucker intrazellulär phosphoryliert und damit kein Substrat für die Mannitol-2-Dehydrogenase. Dieses Problem wurde durch die zusätzliche Expression des Glukose-Facilitators aus Zymomonas mobilis überwunden, der D-Fruktose und D-Glukose durch erleichterte Diffusion ohne Phosphorylierung dieser Zucker, transportiert. Dieser E. coli Stamm war in der Lage, innerhalb von 18 Stunden bis zu 1 M D-Mannitol mit einer Ausbeute von 84 - 90 mol% und einer maximalen spezifischen Produktivität von 9,5 g x (gZTM x h)-1 aus D-Fruktose zu bilden. Da dieser Stamm D-Glukose als Substrat zur D-Mannitol Bildung nicht nutzen konnte, wurden sowohl Glukose-Isomerasen zum Reaktionsansatz zugegeben, als auch die Glukose-Isomerase aus E. coli koexprimiert. Daraufhin bildete E. coli D-Mannitol aus D-Glukose als einziger Kohlenstoff- und Formiat als Elektronendonor, ohne Beteiligung von phosphorylierten Zwischenstufen. Aim of this work was the construction of recombinant Escherichia coli strains for the formation of D-mannitol from D-fructose and D-Glucose in whole-cell biotransformations. First the NAD-dependent mannitol dehydrogenase from Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC12291 was expressed in E. coli. Despite of its high enzyme activity this E. coli strain was not able to form D-mannitol from D-fructose as resting cell susspension in a whole-cell biotransformation. The coexpression of the NAD-dependent formate dehydrogenase of the methylotrophic Mycobacterium vaccae N10 for the regeneration of NADH resulted in the formation of a minor amounts of D-mannitol from D-fructose and formate, again regardless of high enzyme activities in the respective strain. Because D-fructose uptake in wildtype E. coli is catalysed by the PTS-system, this sugar is phosphorylated and therefore not a substrate of the mannitol dehydrogenase. This problem was overcome by the coexpression of the glucose facilitator of Zymomonas mobilis for uptake of D-fructose without concomitant phosphorylation. This strain was able to form D-mannitol up to a concentration of 1 M in a reaction time of 18 hours with a yield YD-mannitol/D-fructose of 84 - 90 mol% from D-fructose and formate as substrates. The maximum specific productivity was 9,5 [gD-mannitol x (gCDW x h)-1]. However, this E. coli strain was not able to form D-mannitol from D-glucose. Therefore, glucose isomerases were supplemented to reaction mixture and the the glucose isomerase from E. coli was coexpressed. In both cases this resulted in D-mannitol formation solely from D-glucose as carbohydrate source and formate as source of redox equivalents without the participation of phosphorylated intermediates.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	03.12.2004
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	02.12.2004
Datum der Promotion:	02.12.2004