Dokument: Etablierung eines neuartigen Protein-Expressionssystems in Ustilago maydis

Titel:	Etablierung eines neuartigen Protein-Expressionssystems in Ustilago maydis
Weiterer Titel:	Establishing a novel protein expression system in Ustilago maydis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=29700
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140606-081753-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Stock, Janpeter [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,16 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.06.2014 / geändert 05.06.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In der industriellen Biotechnologie werden ständig neue nützliche Proteine identifiziert, die mit etablierten Expressionssystemen teilweise nur ineffizient produziert werden können. Daher besteht ein großes Interesse, neue Expressionsplattformen zu entwickeln. Die Sekretion der Produkte ist dabei von Vorteil, da kein aufwendiger Zellaufschluss notwendig ist. Die bei der konventionellen Sekretion in Eukaryonten stattfindende Glykosylierung kann jedoch für bestimmte Produkte, insbesondere zur medizinischen Anwendung, unerwünschte Auswir-kungen haben. In dieser Arbeit wurde daher ein neues Expressionssystem im genetisch gut manipulierbaren Basidiomyceten Ustilago maydis etabliert, das die Sekretion von unglykosy-lierten Proteinen ermöglicht. In diesem pilzlichen Mikroorganismus wird während des fila-mentösen Wachstums mikrotubuliabhängiger mRNA-Transport von dem mRNA-Bindeprotein Rrm4 vermittelt. Dieser Prozess ist für die effiziente Sekretion der Endochitinase Cts1 essen-tiell. In diesem neuen Expressionssystem wird die Sekretionsmaschinerie von Cts1 genutzt, um Zielproteine zu exportieren. Als ‘Proof of Principle‘ wurde die bakterielle β-Glukuronidase (Gus) eingesetzt. Heterolog exprimiertes Enzym wird im Verlauf der eukaryotischen konven-tionellen Sekretion aufgrund einer N-Glykosylierung inaktiviert. Im Gegensatz dazu wurde N-terminal an Cts1 fusioniertes Gus im aktiven Zustand in den Überstand exportiert und bestä-tigte damit die unkonventionell ablaufende Sekretion von Cts1. Die Analyse von verkürzten Cts1-Varianten zeigte außerdem, dass der schwach konservierte N-Terminus für die Sekre-tion von Cts1 abdingbar ist. Mit der Sekretion der Gus-Fusionsproteine wurde außerdem gezeigt, dass der Cts1-Sekretionsmechanismus dazu genutzt werden kann, auch größere heterologe Proteine zu exportieren. Die Produktion von deutlich anspruchsvolleren Proteinen wurde mit der Expression heterologer Lipasen wie CalB getestet, die mit bakteriellen Ex-pressionssystemen schwer zu produzieren sind. Um die Aktivitäten dieser Lipasen bei mög-lichst geringer lipolytischer Hintergrundaktivität analysieren zu können, wurde ein für eine CalB-Typ Lipase kodierendes Gen (uml2) in U. maydis deletiert. Zur Untersuchung der lipoly-tischen Aktivität von CalB-Typ Lipasen in Zellextrakten und Überständen von U. maydis wur-de zudem ein Polysorbat-Assay etabliert. Es zeigte sich, dass die in dem uml2-Deletionsstamm produzierten Lipasen Uml2, CalB und thermostabiles LipT zwar erfolgreich über den Cts1-Sekretionsweg in den Überstand exportiert wurden, jedoch dort inaktiv vorla-gen. Im Gegensatz dazu war konventionell sekretiertes Uml2-Fusionsprotein im Überstand stabil und aktiv. Hiermit zeigt sich, dass auch in diesem, wie in vielen anderen Expressions-systemen, für jedes Produkt individuell getestet werden muss, ob dessen Produktion möglich ist. Mit der erfolgreichen Expression von Gus hat sich jedoch bestätigt, dass dieses neuartige Expressionssystem nach weiterer Optimierung großes Potential besitzt, zukünftig auch in-dustriell relevante Proteine produzieren zu können. In industrial biotechnology new valuable proteins are frequently identified that can only be produced inefficiently with established expression systems. Hence, there is a great interest in developing novel expression platforms. Secretion of products is advantageous since laborious cell disruption is avoided. However, protein glycosylation during conventional secretion in eukaryotes can lead to undesirable effects in certain products, particularly in medical app-lications. Therefore, in this thesis a new expression system was established using the gene-tically amenable basidiomycete Ustilago maydis. Notably, the system allows the secretion of unglycosylated proteins. In this fungal microorganism, microtubule-dependent mRNA trans-port during filamentous growth is mediated by the RNA-binding protein Rrm4. This process is essential for efficient secretion of the endochitinase Cts1. In the novel expression system the secretion apparatus of Cts1 is used to export candidate proteins. As a proof of principle, bac-terial β-glucuronidase (Gus) was used. Heterologously expressed enzyme is inactivated by a N-glycosylation during conventional secretion in eukaryotes. In contrast, Gus fused N-terminally to Cts1 was exported into the supernatant in an active form, confirming the uncon-ventional secretion of Cts1. The analysis of truncated Cts1 variants revealed that the weakly conserved N-terminus is dispensable for secretion of Cts1. By investigating the secretion of the Gus fusion proteins it could be shown that the Cts1 secretion mechanism can be exploit to export larger heterologous proteins. The production of more sophisticated proteins was tested by expressing heterologous lipases like CalB. To allow analysing the activity of these lipases at reduced lipolytic background activities, a gene (uml2) coding for a CalB-type lipase was deleted in U. maydis. To investigate the lipolytic activity of CalB-type lipases in cell extracts and supernatants of U. maydis, a polysorbate assay was established. The lipases Uml2, CalB and thermostable LipT produced in the uml2 deletion strain could successfully be exported by the secretory pathway of Cts1 into culture supernatant, but they were inactive. In contrast, conventionally secreted Uml2 fusion proteins were stable and active in supernatants. This demonstrates that, as observed for many other expression systems, individual testing is necessary to judge the ability of a system to produce a product. However, the successful expression of Gus has shown that following further optimisations in the future this novel expression system has great potential to produce industrially relevant proteins.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	06.06.2014
Dateien geändert am:	06.06.2014
Promotionsantrag am:	21.11.2013
Datum der Promotion:	21.02.2014