Dokument: Identification and optimization of novel bacterial laccases

Titel:	Identification and optimization of novel bacterial laccases
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28823
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140327-113102-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Gunne, Matthias [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,77 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.03.2014 / geändert 25.03.2014
Beitragende:	Prof. Urlacher, Vlada [Betreuer/Doktorvater] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Stichwörter:	laccase, multicopper oxidase, redox potential, copper chaperone, copper content, ssl1, small laccase, cota, copz, bacillus licheniformis, streptomyces sviceus, escherichia coli, expression, crystallization, crystal structure, protein engineering, alkaline laccase
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Laccasen (EC 1.10.3.2) gehören zu den blauen Multikupferoxidasen. Sie verknüpfen die Oxidation von vier Substratmolekülen durch Abstraktion jeweils eines Elektrons mit der Vier-Elektronen-Reduktion von molekularem Sauerstoff. Dabei akzeptieren Laccasen eine Vielzahl unterschiedlicher phenolischer und nicht-phenolischer Aromaten als Substrate. Als Coprodukt entsteht lediglich Wasser. Dadurch können Laccasen in etlichen oxidativen „grünen“ Prozessen genutzt werden. Aktuell werden ausschließlich Laccasen aus Pilzen für industrielle Zwecke eingesetzt, obwohl bakterielle Laccasen eine Reihe von Vorteilen bieten. Diese zeigen meist Aktivität im neutralen bis alkalischen pH-Bereich, sind stabil bei erhöhten Temperaturen und unempfindlicher gegenüber inhibierenden Substanzen. Zudem können sie in prokaryotischen Wirtsorganismen hergestellt werden, was hohe Ausbeuten und eine einfache genetische Manipulation verspricht. Dass sie aktuell nicht in industriellen Prozessen verwendet werden, liegt zum einen an der relativ geringen Zahl charakterisierter bakterieller Laccasen. Zum anderen weisen sie in der Regel niedrige Redoxpotentiale auf. Da die Aktivität von der Redoxpotentialdifferenz zwischen Laccase und Substrat abhängt, sind die Anzahl möglicher Substrate und die spezifische Aktivität bakterieller Laccasen beschränkt. Zum dritten sind heterolog exprimierte bakterielle Laccasen häufig kupferdefizient und erreichen dementsprechend nicht ihre volle Aktivität. In der vorliegenden Arbeit sollte die Nutzbarkeit bakterieller Laccasen verbessert werden, um so in Zukunft einen Einsatz in industriellen Prozessen zu ermöglichen. Um die Anzahl verfügbarer Enzyme zu erhöhen, wurde die Laccase Ssl1 aus Streptomyces sviceus kloniert und charakterisiert. Ssl1 gehört zu den sogenannten kleinen Laccasen, die sich durch eine Architektur aus zwei Domänen auszeichnen. Es besitzt mit phenolischen Substraten Aktivitätsoptima im alkalischen pH-Bereich. Die gemessenen Optima bei pH 9 für Guaiacol und 2,6-Dimethoxyphenol gehören zu den höchsten bekannten Optima von Laccasen. Nicht nur die Aktivität, auch die Stabilität im alkalischen Bereich ist bemerkenswert hoch. So waren nach sieben Tagen bei pH 11 immer noch 75 % Restaktivität vorhanden. Die Stabilität von Ssl1 wurde durch den Zusatz von organischen Lösemitteln und Detergenzien kaum beeinflusst. Die Aktivität von Ssl1 sank durch den Zusatz zwar ab, aber selbst bei einem Anteil von 40 % wassermischbarem organischen Lösemittel konnten mindestens 20 % Aktivität nachgewiesen werden, mit Detergenzien mindestens 60 %. Der Zusatz von 10 mM Natriumazid, einem bekannten Laccaseinhibitor, hatte keinen messbaren Effekt auf die Aktivität oder Stabilität von Ssl1. Auch die Thermostabilität von Ssl1 ist beachtlich. Bei 60 °C lag die Halbwertszeit der Aktivität bei 88 min. Ssl1 hat ein Redoxpotential von 375 mV und muss daher als Laccase mit niedrigem Redoxpotential eingeordnet werden. Um das Redoxpotential von Ssl1 gezielt zu erhöhen, wurde Ssl1 kristallisiert und seine Struktur durch Röntgenkristallographie aufgeklärt. Das ermöglichte die Auswahl und den Austausch von Aminosäuren die das Redoxpotential beeinflussen könnten. Auf diese Weise wurden Ssl1 Varianten mit einer Erhöhung des Redoxpotentials von 16 bis 81 mV erzeugt. Als entscheidende Faktoren wurden der axiale Ligand des Typ 1-Kupferzentrums und die Hydrophobizität in dessen Umgebung identifiziert. Mutationen in unmittelbarer Umgebung des Typ 1-Kupferzentrums störten dabei offensichtlich den Elektronentransport innerhalb der Laccase, was zu geringeren spezifischen Aktivitäten in den entsprechenden Varianten führte. Dagegen waren die Varianten Ssl1 M220L/T222L und Ssl1 ΔC-terminus mit Mutationen abseits des Typ 1-Kupferzentrums in der Lage, die industriellen Farbstoffe Alizarinrot S und Indigokarmin schneller umzusetzen als das Wildtypenzym. Strategien zur Erhöhung der Kupferbeladung heterolog exprimierter bakterieller Laccasen wurde am Beispiel der Modelllaccase CotA aus Bacillus licheniformis untersucht. Dabei zeigte sich, dass eine Erhöhung der intrazellulären Kupferkonzentration durch Ausschalten des aeroben Kupferdetoxifikationsmechanismus in Escherichia coli nicht ausreicht, um den Kupfergehalt von CotA zu steigern. Dagegen führte die Coexpression des zuvor durch Genomscreening identifizierten Kupferchaperons CopZ zu einer Erhöhung des Kupfergehalts um 20 %. Gleichzeitig stieg die spezifische Aktivität von CotA um 26 %. Dadurch war zwar noch keine vollständige Kupferbeladung von CotA erreicht, aber das entwickelte System ist einfach im Gebrauch und verlangt keinen großen experimentellen Zusatzaufwand. Daher kann es in Standardexpressionen eingesetzt werden und dabei die Ausbeuten aktiver CotA-Laccase erhöhen. Laccases (EC 1.10.3.2) belong to the blue multicopper oxidases. They couple the oxidation of four substrate molecules by abstraction of one electron with the reduction of molecular oxygen by four electrons. Laccases accept a wide range of various phenolic and non-phenolic aromatic compounds as substrates and produce water as sole by-product. This makes laccases suitable enzymes for a variety of 'green' oxidation processes. At the moment, exclusively laccases from fungi are used in industrial processes, although laccases from bacteria provide several benefits. Often these are active in neutral to alkaline conditions, they are stable at elevated temperatures and tolerate the presence of common laccase inhibitors. Moreover, they can be produced in prokaryotic expression hosts. This allows simple genetic manipulation and high production yields. The industrial utilization of bacterial laccases is hindered by the low number of characterized enzymes. Further, since the activity depends on the redox potential difference between laccase and substrate, the substrate range and the specific activity of bacterial laccases are limited. Additionally, copper depletion is frequently reported for heterologously expressed bacterial laccases which results in partially inactive enzyme. In the presented work, the usability of bacterial laccases should be improved to facilitate utilization of these versatile enzymes in industrial processes. The number of available enzymes was increased by cloning and characterization of the laccase Ssl1 from Streptomyces sviceus. Ssl1 is a so-called small laccase with a two-domain architecture. It possesses alkaline activity optima with phenolic substrates. The demonstrated optima at pH 9 with guaiacol and 2,6-dimethoxyphenol belong to the highest reported pH optima of laccases. Besides the activity, the stability of Ssl1 at alkaline pH was remarkably high. After seven days at pH 11 a residual activity of 75 % could be observed. The addition of organic solvents and detergents did hardly affect the stability of Ssl1. Although the activity of Ssl1 decreased, even with addition of 40 % water miscible organic solvent at least 20 % activity was detected. With detergents at least 60 % remaining activity was observed. Addition of 10 mM of the common laccase inhibitor sodium azide did not alter the activity of Ssl1. Moreover, the thermostability of Ssl1 is noteworthy. Thus, the half-time of residual Ssl1 activity at 60 °C was 88 min. Ssl1 displays a redox potential of 375 mV and, therefore, belongs to low redox potential laccases. To increase its redox potential, first Ssl1 was crystallized and its structure was solved by X-ray crystallography. This enabled rational selection and substitution of amino acids that might influence the redox potential of Ssl1. Thereby created variants showed redox potential increases of 16 to 81 mV. The nature of the axial ligand of the type-1 copper ion and the hydrophobicity in its environment were identified as key determinants of the redox potential of Ssl1. Obviously, mutations close to the type-1 center perturbed the intermolecular electron transfer and resulted in lower specific activities of corresponding variants. The variants Ssl1 M220L/T222L and Ssl1 ΔC-terminus with mutations at larger distance to the type-1 center were able to convert the industrial dyes Alizarin Red S and indigo carmine more efficiently than wildtype enzyme. Strategies for increasing the copper content of heterologously expressed bacterial laccases were tested with the model laccase CotA from Bacillus licheniformis. It was demonstrated that an increased intracellular copper concentration by knock-out of the aerobic copper detoxification mechanism in Escherichia coli was insufficient to increase the copper content of CotA. In contrast, coexpression of the copper chaperone CopZ that was identified by genome screening increased the copper content by 20 %. At the same time the specific activity of CotA increased by 26 %. Although a full copper complement could not be achieved, the established system is simple to use and does hardly require additional experimental efforts. As a consequence it can be used in standard expressions in order to maximize the yield of active CotA laccase.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	27.03.2014
Dateien geändert am:	27.03.2014
Promotionsantrag am:	09.01.2014
Datum der Promotion:	13.03.2014