Dokument: Development of a biocatalytic production process for (S)-a-hydroxy ketones

Titel:	Development of a biocatalytic production process for (S)-a-hydroxy ketones
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28451
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140307-121508-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Baraibar, Alvaro Gomez [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,16 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.02.2014 / geändert 19.02.2014
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Enantiomerenreine α-Hydroxyketone sind vielseitige Bausteine für die pharmazeutische Industrie. Da hoch chemo- und stereoselektive Synthesen dieser Verbindungen mit herkömmlichen, chemischen Verfahren sehr schwierig sind, bietet der Einsatz von Biokatalysatoren bei der Produktion von α-Hydroxyketonen eine interessante Alternative. Thiamin-Diphosphat (ThDP)-abhängige Enzymen sind in der Lage, α-Hydroxyketone durch Carboligation zweier kostengünstigen Aldehyden herzustellen. In der Arbeitsgruppe Biokatalyse und Biosensoren (IBG -1, Forschungszentrum Jülich GmbH) um Prof. Pohl und Dr. Rother gibt es eine Enzym-Toolbox, die zahlreiche ThDP-abhängige Enzyme umfasst. Durch dieses Spektrum an Enzymen kann eine breite Plattform an α-Hydroxyketonen mit hohen Reinheiten hergestellt werden. Allerdings sind die meisten der Wildtyp-Enzyme (R)-selektiv für die Carboligation, wenn mindestens einer der für die Carboligation verwendeten Aldehyde aromatisch ist. Die Synthese von aromatischen und aromatisch-aliphatischen Hydroxyketonen in (S)-Konfiguration ist daher schwieriger. In dieser Arbeit wurde mit der Variante E469G der Pyruvatdecarboxylase aus Acetobacter pasteurianus (ApPDCE469G) eines der wenigen (S)-selektiven Enzyme verwendet, um ein Verfahren zur Produktion von (S)-Phenylpropionylcarbinol (PPC) im Labormaßstab zu entwickeln. Für diesen Prozess wurden folgenden Ziele erreicht: - Reaktionscharakterisierung und -optimierung: Durch eine Kombination aus der Wahl von Substraten und Lösungsmitteln mit einer umfassenden Reaktionsoptimierung, konnte die spezifische Raum-Zeit-Ausbeute des Prozesses um das 61-fache erhöht werden. Das beweist, dass eine Optimierung von Reaktionsbedingungen einen immensen Einfluss auf die Produktivität und die Selektivität des Katalysators haben. Ferner konnte die Enantiomerenreinheit des Produkts von 89 % auf 98 % (S)-PPC verbessert werden. Die Vermeidung von organischen Lösungsmitteln (zur Erhöhung der Substratlöslichkeit) und die Verwendung eine α-Ketosäure anstelle des Donor-Aldehyds, trugen wesentlich zu dem verbesserten Reaktionsprozess bei. - Verwendung von ganzen Zellen: alternativ zu gereinigten Enzymen, wurde die Verwendung von ganzen Zellen bei der Herstellung von (S)-PPC untersucht und optimiert. Die Rezyklierbarkeit der Zellen wurde bestimmt und die Reaktion in einem 500 mL Reaktionsgefäß mit einer kontinuierlichen Substratzugabe durchgeführt. Dabei konnte eine Produkt-Konzentrationen von über 10 g / L / d erreicht werden. Als Nachteile der Ganzzelle-Biokatalyse ist zu nennen, dass das Produkt einen leicht verringerten Enantiomerenüberschuss im Vergleich zum Verfahren mit gereinigtem Enzym hatte und dass ein noch unbekanntes Nebenprodukt auftrat. Des Weiteren wurde das Ganzzell-Verfahren erfolgreich auch für die Herstellung von (S)-Phenylacetylcarbinol (aus Pyruvat und Benzaldehyd) getestet. Damit konnte generell gezeigt werden, dass der Prozess auch analog auf die Synthese von anderen (S)-konfigurierten Hydroxyketonen übertragbar ist. - Entwicklung einer Strategie zur Steigerung der Enantiomerenreinheit: Um das leicht anwendbare Ganzzell-Katalyse Verfahren anwendbar zu machen und um den 7 Nachteil der nur moderate Stereoselektivität zu überwinden, wurde eine neue Strategie zur Steigerung der Enantiomerenreinheit erfunden. Durch die Verwendung eines zweiten, rein (R)-selektiven ThDP-abhängiges Enzyms, das in der Lage ist, (R)-α-Hydroxyketone in Aldehyde zu spalten, wird das entsprechende (S)-konfigurierte Enantiomer angereichert. Die gebildeten Aldehyde stehen darüber hinaus wieder für die von der ApPDCE469G katalysierten Carboligation zur Verfügung, was sowohl die Ausbeute wie auch die Enantiomerenreinheit des (S)-konfigurierten Produkts weiter erhöht. Enantiomerically pure α-hydroxy ketones are versatile building blocks for the pharmaceutical industry. Since the highly chemo- and stereoselctive synthesis of these compounds is very challenging with traditional chemical synthesis, the use of biocatalysis for the α-hydroxy ketone production is an interesting alternative. One of the most promising alternatives is the use of thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes, which are able to produce these hydroxy ketones by carboligation of two inexpensive aldehydes. The enzyme toolbox available in the Biocatalysis & Biosensors group at IBG-1, Forschungszentrum Jülich GmbH, includes numerous ThDP-dependent enzymes, which are able to synthesise a wide palette of hydroxy ketones with high selectivity. However, most of the wild-type enzymes are (R)-selective for the carboligation if at least one of the aldehydes used for the carboligation is aromatic, making the synthesis of aromatic and mixed aliphatic/aromatic (S)-hydroxy ketones more challenging. In this work, with the Acetobacter pasteurianus pyruvate decarboxylase variant E469G (ApPDCE469G), one of the few designed (S)-selective variants, a lab scale production process for (S)-phenyl propionyl carbinol (PPC) has been developed. In order to do this, several tasks have been performed: - Reaction characterization and optimization: By combining appropriate choice of substrates and solvent as well as reaction engineering the specific space-time-yield could be increased up to 61 fold, proving the immense impact of suitable reaction condition on both, catalyst productivity and selectivity. Further, the enantiomeric excess of the product could be improved from 89 % up to 98 % (S)-PPC. Especially avoidance of organic co-solvents, used as substrate solubility enhancers, as well as the exchange of the donor aldehyde by its corresponding α-keto acid, which is decarboxylated to the aldehyde prior to carboligation by the same enzyme, were essential for the enhancement. - Use of whole cell: alternatively to purified enzyme, the use of whole cells for the production of (S)-PPC has also been evaluated and optimized. Recyclabillity of the cells was determined and the reaction was scaled up in a 500 mL stirred tank reactor with a substrate fed, achieving product concentrations over 10 g/L/d. The drawbacks of the whole cell catalysis were a slighly lower enantiomeric excess of the product compared with pure enzyme and the occurrence of a new by-product. This procedure was also successfully tested for the production of (S)-phenylacetylcarbinol from pyruvate and benzaldehyde in order to verify that the process extrapolation to other (S)-hydroxy ketones is possible. - Development of an enantiomeric excess enhancement strategy: In order to make use of the easy applicable whole cell catalysis and to overcome the drawback of only moderate stereoselectivity, a new strategy to increase stereoselctivity, called `chiral polishing´ was invented. By using a second, strictly (R)-selective ThDP-dependent enzyme, which is able to cleave (R)-α-hydroxy ketones into aldehydes but does not except the (S)-enantiomer the undesired (R)-enantiomer can be removed and the 5 aldehydes formed are again available for the carboligation step by the ApPDCE469G yielding a highly (S)-selective product.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	07.03.2014
Dateien geändert am:	07.03.2014
Promotionsantrag am:	16.10.2013
Datum der Promotion:	06.11.2013