Dokument: Einfluß von Adipokinen auf die Funktion glatter Muskelzellen und die Entstehung von Atherosklerose

Titel:	Einfluß von Adipokinen auf die Funktion glatter Muskelzellen und die Entstehung von Atherosklerose
Weiterer Titel:	Involvment of adipokines in the induction of smooth muscle cell dysfunction and the development of arteriosclerosis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28226
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140130-093411-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Wronkowitz, Nina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,17 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 28.01.2014 / geändert 28.01.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Eckel, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Fettgewebe wurde lange Zeit nur als ein Depot zur Speicherung von Lipiden angesehen. Mittlerweile ist jedoch hinreichend bekannt, dass es sich hierbei ebenso um ein endokrines Organ handelt, welches eine große Anzahl von Proteinen und bioaktiven Peptiden, auch Adipokine genannt, sezerniert. Diese Adipokine beeinflussen Prozesse wie Metabolismus, Inflammation und Koagulation. Im Krankheitsbild der Adipositas wird die physiologische Funktion des Fettgewebes durch die Hypertrophie der Adipozyten und die chronische Inflammation innerhalb des Fettgewebes gestört. Die Fehlfunktion des Fettgewebes führt zu einer veränderten Produktion und Sekretion der Adipokine, welche wiederum zahlreiche periphere Gewebe wie Leber, Skelettmuskel und Blutgefäße sowohl endo- als auch parakrin beeinflussen. Im Kontext der Adipositas wurde dem Fettgewebe eine Schlüsselrolle in der Pathogenese des Type 2 Diabetes und kardiovaskulärer Erkrankungen zugeschrieben. Bis heute ist jedoch das Sekretom der Adipozyten noch nicht vollständig aufgeklärt, so dass fortlaufend neue Adipokine entdeckt und validiert werden. In einer vorrausgegangenen Proteom-Analyse des Sekretoms humaner Adipozyten konnte unsere Arbeitsgruppe lösliches DPP4 (sDPP4) als neues Adipokin identifizieren. DPP4 ist ein ubiquitär expremiertes Oberflächenprotein mit Protease-Aktivität, welches vor allem durch die Degradierung der Inkretinhormone als wichtiger Regulator des Blutzuckerspiegels bekannt ist. Durch Abspaltung von der Zellmembran wird eine lösliche Form dieses Proteins im Plasma und in anderen Körperflüssigkeiten freigesetzt. Demzufolge war das erste Ziel dieser Dissertation, sDPP4 als neues Adipokine zu charakterisieren und zu validieren. Hierbei konnten wir zeigen, dass während der Adipozytendifferenzierung die Freisetzung von sDPP4 deutlich ansteigt und dass Adipozyten hauptsächlich für die Freisetzung von sDPP4 aus dem Fettgewebe in die Blutzirkulation verantwortlich sind. Die Untersuchung verschiedener Fettdepots zeigte, dass DPP4 am höchsten im viszeralen Fettgewebe adipöser Patienten exprimiert wird. Dementsprechend wies das Serum adipöser Patienten erhöhte Level von sDPP4 auf, welche zudem mit Parametern des Metabolischen Syndroms korrelierten. Endo- und parakrine Effekte dieses Proteins konnten in Form einer sDPP4-induzierten Verminderung der Insulin Signalweiterleitung in Adipozyten und Skeletmuskelzellen aufgezeigt werden. Es ist hinreichend bekannt, dass die mit Adipositas einhergehende Expansion des Fettgewebes negativen Einfluss auf die Zellen der Gefäßwand, besonders auf glatte Muskelzellen, ausübt. Daher befasste sich das zweite Ziel dieser Arbeit mit der Untersuchung direkter Effekte sDPP4s auf humane vaskuläre glatte Muskelzellen. Hierbei charakterisierten wir einen neuen sDPP4-induzierten und Rezeptor-vermittelten Signalweg. Unter Verwendung physiologischer DPP4 Konzentrationen zeigte sich sowohl eine kurzzeitige als auch eine längerfristige Aktivierung von ERK1/2. Zusätzlich wurde eine DPP4-vermittelte Phosphorylierung der NF-κB Untereinheit p65 beobachtet. Als Folge der ERK und NF-κB Aktivierung induziert sDPP4 sowohl die Expression von iNOS als auch die Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-6, IL-8 und MCP-1. In Übereinstimmung mit dem sDPP4-induzierten Stress-Signal, führte sDPP4 zu einer erhöhten Proliferation und zur Verminderung der Insulin-Signalweiterleitung in vaskulären glatten Muskelzellen. Alle direkten Effekte von sDPP4 auf die verschiedenen Signalwege, Proliferation und Inflammation konnten vollständig durch die enzymatische Inhibition von DPP4 verhindert werden. In Anbetracht der DPP4-induzierten Signalwege und durch bioinformatische Analyse stellte sich sDPP4 als möglicher Agonist des Protease-aktivierten Rezeptors 2 heraus. Durch die Hemmung der Genexpression und Einsatz eines spezifischen Antagonisten dieses Rezeptors konnten die sDPP4-induzierten Effekte auf die Proliferation und Inflammation vollständig inhibiert werden. Ein weiteres Thema dieser Arbeit befasste sich mit dem atherogenen Einfluss des gesamten Adipozytensekretoms in Form von konditioniertem Medium (CM) auf differenzierte vaskuläre glatte Muskelzellen. CM steigerte die Expression des für glatte Muskeln specifischen α-Aktins, des miRNA-143/145 Clusters und verminderte deutlich die Insulin-vermittelte Phosphorylierung von Akt und seinem Substrat eNOS. Zudem führte das CM zu einer vermehrten Phosphorylierung von SMAD2 und p38, welche beide in Verbindung mit der Induktion des miRNA-134/145 Clusters stehen. Demzufolge konnte sowohl die durch CM bedingte Induktion des miRNA-143/145 Clusters als auch die Inhibition der Insulin-vermittelten Akt und eNOS Phosphorylierung durch pharmakologische Inhibition von Alk-4/5/7 und p38 verhindert werden. Die Transfektion von vaskulären glatten Muskelzellen mit Precursor miRNA-143, jedoch nicht mit Precursor miRNA-145, resultierte in einer verminderten Insulin-vermittelten Akt und eNOS Phosphorylierung. Die Inhibition des Insulins Signalweges sowohl durch CM als auch miRNA-143 war mit einer reduzierten Expression von oxysterol-binding protein-related protein 8 (ORP8) assoziiert. Letztendlich führte die Inhibition der ORP8 Expression ebenfalls zu einer verminderten, Insulin-vermittelten Akt Phosphorylierung in vaskulären glatten Muskelzellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sDPP4 als neues Adipokin charakterisiert und validiert wurde. Ebenfalls wurde das atherogene Potential sowohl dieses neuen Adipokins als auch des gesamten Adipozytensekretoms auf Ebene der vaskulären glatten Muskelzellen untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass sDPP4 möglicherweise eine Rolle als molekularer Link zwischen Adipositas und dem Metabolischen Syndrom sowie kardiovaskulären Erkrankungen spielt. Zudem konnte mit der Untersuchung der miRNAs ein neuer Aspekt in dem komplexen Crosstalk zwischen Adipozyten und glatten Muskelzellen der Gefäßwand aufgezeigt werden. Adipose tissue has long been seen as a passive lipid storage depot but it is now considered as an endocrine organ releasing a large number of proteins and bioactive peptides, the so-called adipokines. These adipokines affect several processes, such as metabolism, inflammation and coagulation. In obesity, adipocyte hypertrophy and the chronic low-grade inflammation within adipose tissue affects its normal physiological function. Adipose tissue dysfunction results in an altered production and secretion of adipokines, which in turn affects several peripheral tissues in an endo- and paracrine manner such as liver, skeletal muscle and the vasculature. Thus, in the context of obesity, adipose tissue has gained considerable interest as a key player in the pathogenesis of several metabolic diseases, such as type 2 diabetes and cardiovascular disease. However, the secretome of adipocytes remains still incompletely characterized and the discovery and validation of new adipocyte-derived factors is still in progress. With comprehensive proteomic profiling of the human adipocyte secretome our working group previously identified soluble DPP4 (sDPP4) as novel adipokine. DPP4 is a ubiquitously expressed cell-surface protease, which is widely known for its role in glycaemic control through catabolism of incretin hormones. Due to shedding from the membrane, a soluble form of DPP4 lacking the cytoplasmatic tail and the transmembrane region can be found in plasma and other body fluids. Therefore, the first aim of this thesis was to further characterize and validate sDPP4 as novel adipokine. Here, we demonstrated that sDPP4 release is considerably increased during adipocyte differentiation. Comparison with preadipocytes and adipose tissue macrophages showed that adipocytes most likely represent the major source of sDPP4, which is released from the intact organ into the circulation. Comparing different fat depots, DPP4 shows the highest expression in visceral adipose tissue of obese patients. Accordingly, circulating levels of sDPP4 were increased in obesity and correlate with parameters of the metabolic syndrome. Furthermore, sDPP4 exerts autocrine and paracrine effects as shown by impaired insulin signaling in adipocytes and skeletal muscle cells. It is well accepted that expanded fat mass in obesity negatively affects cells of the vascular wall, especially smooth muscle cells. Therefore, the second objective of this thesis was to study direct effects of sDPP4 on human vascular smooth muscle. We characterized a novel sDPP4-induced and receptor-mediated signaling cascade. Using physiological concentrations of sDPP4, we observed a short- as well as a long-term activation of ERK1/2. Additionally, sDPP4 treatment induced phosphorylation of the NF-κB subunit p65. Downstream of ERK and NF-κB, sDPP4 leads to iNOS induction and increased expression and release of pro-inflammatory cytokines, such as interleukin-6, interleukin-8 and monocyte chemoattractant protein-1. In accordance with sDPP4-induced stress and inflammatory signaling, sDPP4 stimulates proliferation and impairs insulin signaling in vascular smooth muscle cells. All direct effects of sDPP4 on signaling, proliferation and inflammation were completely prevented by enzymatic inhibition of sDPP4. Bioinformatic analysis and signaling signature induced by sDPP4 suggest that sDPP4 might be an agonist for protease-activated receptor 2. After silencing of this receptor and using a receptor antagonist, sDPP4-induced proliferation and inflammation was totally abolished. A further topic of this work was to address the atherogenic impact of the whole secretory output of human adipocytes in terms of conditioned medium (CM) on differentiated human vascular smooth muscle cells. CM increased the expression of smooth muscle α-actin, and the miRNA-143/145 cluster, but markedly impaired the insulin-mediated phosphorylation of Akt and its substrate endothelial nitric oxide synthase (eNOS). Furthermore, CM promoted the phosphorylation of SMAD2 and p38, which have both been linked to miRNA-143/145 induction. Accordingly, the induction of miRNA-143/145 as well as the inhibition of insulin-mediated Akt- and eNOS-phosphorylation was prevented when vascular smooth muscle cells were treated with pharmacological inhibitors for Alk-4/5/7 and p38 before the addition of CM. Transfection of vascular smooth muscle cells with precursor miRNA-143, but not with precursor miRNA-145, resulted in impaired insulin-mediated phosphorylation of Akt and eNOS. This inhibition of insulin signaling by CM and miRNA-143 is associated with a reduction in the expression of the oxysterol-binding protein-related protein 8 (ORP8). Finally, knock-down of ORP8 resulted in impaired insulin-mediated phosphorylation of Akt in hVSMC. In conclusion, sDPP4 was characterized and validated as novel adipokine. Furthermore, the atherogenic impact of this novel adipokine and of the whole secretory output of adipocytes was investigated on the level of vascular smooth muscle cells. In this context, we identified sDPP4 as a promising candidate linking obesity to the metabolic syndrome and cardiovascular disease. The presented work also illustrated miRNAs as novel players in the complex crosstalk between adipocytes and vascular smooth muscle cells.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	30.01.2014
Dateien geändert am:	30.01.2014
Promotionsantrag am:	16.12.2013
Datum der Promotion:	27.01.2014