Dokument: Expressionssysteme für die heterologe Proteinproduktion in Candida utilis

Titel:	Expressionssysteme für die heterologe Proteinproduktion in Candida utilis
Weiterer Titel:	Expression systems for heterologous protein production in candida utilis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=28156
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20140127-115946-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kunigo, Maya [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,24 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.01.2014 / geändert 21.01.2014
Beitragende:	Prof. Dr. Ernst, Joachim F. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Freudl, Roland [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Futterhefe Candida utilis verwertet ein breites Spektrum kostengünstiger Substrate einschließlich der Pentose Xylose und wächst damit über einen weiten pH-Bereich zu hohen Zelldichten. Ziel dieser Arbeit war es, C. utilis als sicheren Wirtsorganismus für die Produktion heterologer Proteine zu optimieren und neue Expressionsvektoren zu etablieren. Es konnte festgestellt werden, dass eine Expressionskassette für das bakterielle sat1-Gen unter transkriptioneller Kontrolle des ACT1-Promotors aus Candida albicans auch in C. utilis funktionell ist und die Selektion von Transformanten in Gegenwart von Nourseothricin erlaubt. Verschiedene C. utilis-Promotoren wurden an das GFP-Reportergen fusioniert und in Expressionsvektoren eingebaut. Die Fluoreszenz von Transformanten mit chromosomal integrierten Expressionsplasmiden wurde verglichen. Der Promotor des TDH3-Gens für Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase stellte sich als besonders geeignet für die konstitutive Genexpression heraus. Um eine geregelte Genexpression zu erreichen, wurden einige durch Xylose transkriptionell-regulierte Gene identifiziert und ihre Promotoren wurden in GFP-Fusionen getestet. Dabei erwies sich der Promotor des GXS1-Gens für einen Glukose/Xylose-Symporter als stark Xylose-induzierbar, während er durch Glukose reprimiert wurde. Beide Promotortypen führten auch zu einer effektiven und geregelten Sekretion der Lipase B aus Candida antarctica (CalB). Die neuen Expressionsvektoren waren in vier Hefearten funktionell, da sie außer in C. utilis auch in der vermuteten teleomorphen (sexuellen) Form Pichia jadinii, der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae und dem pathogenen Pilz C. albicans die heterologe Genexpression vermittelten. Für die Entwicklung eines integrativen Transformationssystems ist die Kenntnis der Genomploidie des Wirtsorganismus bedeutend. Daher wurde durch Quantifizierung der nukleären DNA die Ploidie von C. utilis und P. jadinii im Vergleich zu S. cerevisiae-Stämmen mit bekannter Ploidie bestimmt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass C. utilis ein triploides und P. jadinii ein diploides Genom enthält. Überraschenderweise verlief die chromosomale Integration von Expressionsplasmiden in C. utilis vorzugsweise nicht über homologe Rekombination, sondern ektopisch, an unbekannter Stelle im Genom. Außerdem wurde ein häufiger Verlust der Expressionsplasmide bei nicht-selektivem Wachstum beobachtet. Bei der homologen Integration im HIS3-Lokus wurde eine Verbesserung der genomischen Stabilität der integrierten Expressionsplasmide festgestellt. Xylan ist als Polymer der Xylose eine reichlich verfügbare und kostengünstige Kohlenstoffquelle. Um die Xylan-Verwertung zu erreichen, wurde die Xylanase xynA aus Penicillium simplicissimum heterolog in C. utilis exprimiert. Hierfür wurde die Präpro-Sequenz des α-Faktor-Vorläuferproteins Mfα1 aus S. cerevisiae an das xynA-Gen fusioniert und in die sat1-Expressionsvektoren unter Kontrolle des TDH3-Promoters eingebaut. Transformanten mit chromosomal im TDH3-Genlokus integrierten Expressionsplasmiden zeigten die effektive Sekretion von korrekt prozessierter und enzymatisch aktiver Xylanase in das Kulturmedium. Von entscheidender Bedeutung war, dass die heterologe xynA-Expression das Wachstum von Transformanten mit Xylan als Kohlenstoffquelle erlaubte. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse das große Potenzial von C. utilis als effektiver Wirtsorganismus für die Produktion heterologer Proteine. The fodder yeast Candida utilis assimilates a wide range of cost-efficient substrates including the pentose xylose and grows over a broad pH-scale to high cell densities. The aim of this dissertation was to optimize C. utilis as a safe host organism for the production of heterologous proteins and to establish new expression vectors. It was discovered that an expression cassette for the bacterial sat1 gene under the transcriptional control of the ACT1 promoter of Candida albicans is also functional in C. utilis and allows the selection of transformants in the presence of nourseothricin. Different C. utilis promoters were fused to the GFP reporter gene and inserted into expression vectors. Fluorescence of the transformants containing chromosomally integrated expression plasmids was compared. The promoter of the TDH3 gene encoding glycerinaldehyd-3-phosphate dehydrogenase was especially effective to drive constitutive gene expression. To achieve regulated gene expression several genes regulated transcriptionally by xylose were identified and their promoters were tested in GFP fusions. In particular, the promoter of the GXS1 gene encoding a glycose/xylose symporter was highly inducible by xylose, while it was repressed by glucose. Both promoter types also led to an effective and regulated secretion of lipase B from Candida antarctica (CalB). The new expression vectors were functional in four yeast species since they mediated heterologous gene expression not only in C. utilis but also in its assumed teleomorphic (sexual) form Pichia jadinii, baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae and the pathogenic fungus C. albicans. For the development of an integrative transformation system, knowledge of the genome ploidy of the host organism is important. Therefore, by quantification of the nuclear DNA, the ploidy of C. utilis and P. jadinii was determined by comparisons to S. cerevisiae strains with known ploidies. The results strongly suggest that C. utilis contains a triploid and P. jadinii a diploid genome. Surprisingly, chromosomal integration of expression plasmids occurred mostly not by homologous recombination but ectopically at unknown positions in the genome. Furthermore, frequent loss of expression plasmids was observed under non-selective growth. Homologous integration into the HIS3 locus was found to improve genomic stability of the integrated expression plasmids. Xylan is as a polymer of xylose, a highly available and cost-effective carbon source. To achieve xylan assimilation the xylanase xynA from Penicillium simplicissimum was heterologously expressed in C. utilis. For this purpose the prepro sequence of α factor precursor Mfα1 from S. cerevisiae was fused to the xynA gene and was inserted into the sat1 expression vectors under the control of the TDH3 promoter. Transformants containing expression plasmids chromosomally integrated in the TDH3 locus showed effective secretion of correctly processed and enzymatically active xylanase into the culture medium. Importantly, heterologous xynA expression allowed the growth of transformants with xylan as the carbon source. In summary, the results demonstrate the great potential of C. utilis as an effective host organism for the production of heterologous proteins.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	27.01.2014
Dateien geändert am:	27.01.2014
Promotionsantrag am:	31.10.2013
Datum der Promotion:	03.12.2013