Dokument: Sekretorische Gewinnung von Enzymen aus dem thermoalkaliphilen Bakterium Anaerobranca gottschalkii im mesophilen Wirt Staphylococcus carnosus

Titel:	Sekretorische Gewinnung von Enzymen aus dem thermoalkaliphilen Bakterium Anaerobranca gottschalkii im mesophilen Wirt Staphylococcus carnosus
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=2789
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20040405-000789-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Vollstedt, Angela [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,21 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2007 / geändert 09.02.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Freudl, R. [Gutachter] Prof. Dr. Hollenberg, Cornelis P. [Gutachter]
Stichwörter:	Proteinsekretion, Tat-Weg, Staphylococcus carnosus, Extremophileprotein secretion, twin arginine translocation, extremophiles, Gram positive bacteria
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibung:	Enzyme extremophiler Mikroorganismen besitzen ein großes Potential als Biokatalysatoren für industrielle Anwendungen. Für die Gewinnung solcher "Extremozyme" fehlen bislang allerdings überzeugende Expressionssysteme. Im Gegensatz zu Ansätzen zu einer intrazellulären Enzymproduktion bietet eine sekretorische Proteingewinnung mit mesophilen Gram-positiven Bakterien wie Staphylococcus carnosus den Vorteil, dass die gewünschten Proteine direkt in den Kulturüberstand sekretiert werden. S. carnosus eignet sich als Produktionswirt deshalb besonders, weil dieser im Gegensatz zu den meisten anderen Gram-positiven Bakterien keine Proteasen in den Kulturüberstand sezerniert, die die Ausbeute an sekretierten heterologen Proteinen beeinträchtigen können. In der vorliegenden Arbeit wurden daher Expressionssysteme für eine sekretorische Produktion von Extremozymen des thermoalkaliphilen Bakteriums Anaerobranca gottschalkii im Wirt S. carnosus etabliert. Prinzipiell stehen in den meisten Gram-positiven Bakterien zwei Sekretionswege zur Verfügung. Dabei handelt es sich einerseits um den allgemeinen Sec-Weg, der bereits seit langem für die sekretorische Proteingewinnung verwendet wird. Die Sec-abhängige Sekretion von heterologen Proteinen, bei der diese in ungefalteter Form über die Plasmamembran transloziert werden und außerhalb des Cytosols ihre korrekte Konformation einnehmen müssen, verläuft allerdings häufig ineffizient. Fremdproteine sind oft nicht in der Lage, nach erfolgter Membrantranslokation in der Zellhülle schnell genug zu falten, um einem Abbau durch in der Zellwand lokalisierte Proteasen zu entgehen. Der erst kürzlich entdeckte Tat-Weg, für den eine biotechnologische Anwendung in Gram-positiven Bakterien bislang noch nicht beschrieben wurde, besitzt dagegen die herausragende Eigenschaft, bereits fertig gefaltete Proteine aus der Zelle auszuschleusen. Die für die Tat-abhängige Membrantranslokation notwendige Faltung von Vorläuferproteinen im Cytosol vermeidet dabei die genannten Probleme, die die Sec-abhängige Gewinnung heterologer Proteine beeinträchtigen. Dieser neue Exportweg eröffnet zum ersten Mal die Möglichkeit, solche Proteine in Bakterien sekretorisch zu gewinnen, die mit einer Sekretion über den Sec-Weg bislang nicht oder mit nur geringer Effizienz produziert werden können. Um die Nutzung des Tat-Weges für eine heterologe Proteinsekretion im Wirt S. carnosus zu erschließen, wurde im Rahmen dieser Arbeit zunächst untersucht, ob S. carnosus einen funktionellen Tat-Weg besitzt, und ob dieser in der Lage ist, Fremdproteine aus der Zelle zu sekretieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Fusion zweier Modellproteine aus A. gottschalkii, eines intrazellulären Branching Enzyme und einer extrazellulären CGTase, mit der Signalsequenz des E. coli Tat-Substrates TorA zur Sekretion beider Enzyme in aktiver Konformation in den Kulturüberstand von S. carnosus führte. Die Inaktivierung des putativen Rezeptors der Tat-Translokase, TatC, führte zur Inhibierung der Sekretion der beiden Enzyme in S. carnosus. Damit wurde erstmalig nachgewiesen, dass S. carnosus einen funktionellen Tat-Weg besitzt, der grundsätzlich für die heterologe Proteingewinnung geeignet ist. Die biotechnologische Nutzbarkeit des Tat-Weges wurde daraufhin durch eine vergleichende Sec- bzw. Tat-abhängige Sekretion der Modellenzyme Branching Enzyme und CGTase aus A. gottschalkii in S. carnosus evaluiert. Dabei zeigte sich, dass eine Sec-abhängige Produktion von Branching Enzyme und CGTase in S. carnosus nur bedingt geeignet ist. Die alleinige Fusion der Modellproteine mit der Signalsequenz einer Sec-abhängigen Lipase aus S. hyicus führte in beiden Fällen nicht zur Sekretion über den Sec-Weg von S. carnosus. Eine Sec-abhängige Sekretion wurde erst durch zusätzliches Einfügen eines Propeptides möglich, für das bekannt ist, dass es sich positiv auf die Sekretion heterologer Proteine auswirkt. Allerdings war der Einsatz des Propeptids für eine sekretorische Gewinnung der Modellenzyme trotz der Sekretion großer Mengen an Propeptid-Fusionsprotein ebenfalls ungeeignet. Das Propeptid interferierte mit der korrekten Faltung des Branching Enzyme, so dass ausschließlich enzymatisch inaktives Protein in den Kulturüberstand gelangte, während im Falle der CGTase das sekretierte Pro-CGTase Fusionsprotein durch zellassoziierte Proteasen in der Zellhülle abgebaut wurde und nur geringe Mengen des intakten Fusionsproteins in den Überstand gelangten. Eine Sekretion der authentischen CGTase mit ihrer eigenen Signalsequenz über den Sec-Weg von S. carnosus war zwar prinzipiell möglich, führte jedoch zur Sekretion nur sehr geringer Mengen an reifer CGTase in den Kulturüberstand. Dennoch zeigte dieser Befund, dass Sec-Signalsequenzen aus extremophilen Bakterien mit dem Sec-Apparat mesophiler Bakterien produktive Wechselwirkungen eingehen können. Im Vergleich zu den Ansätzen zur Sec-abhängigen Sekretion der Modellproteine konnten mit einer Tat-abhängigen Sekretion von Branching Enzyme und CGTase jeweils die höchsten Enzymaktivitäten im Kulturüberstand erzielt werden. Dieser Weg stellt demnach die Methode der Wahl für eine sekretorische Gewinnung dieser Enzyme in S. carnosus dar. Die erfolgreiche Tat-abhängige Gewinnung je eines heterologen intra- und extrazellulären Enzyms, deren Sekretion über den Sec-Weg in S. carnosus nur mit geringer Effizienz stattfand beweist, dass der Tat-Weg eine vielversprechende Alternative zur Sec-abhängigen Proteingewinnung darstellt. Offensichtlich ist es vorteilhaft, wenn heterologe Proteine ihre native Konformation unter Ausnutzung der cytosolischen Chaperone einnehmen können und erst anschließend im gefalteten Zustand über den Tat-Weg aus der Zelle ausgeschleust werden. Es wurde jedoch auch nachgewiesen, dass das Potential der Tat-abhängigen Sekretion heterologer Proteine durch den Siebeffekt der Zellwand limitiert wird. An Hand der Tat-abhängig sekretierten CGTase wurde gezeigt, dass der Grossteil des translozierten Enzyms im Zellwandkompartiment akkumuliert und sehr wahrscheinlich nur durch Zellwandturnover in den Kulturüberstand freigesetzt wird. Eine Tat-abhängige Gewinnung heterologer Proteine in Gram-positiven Bakterien bietet sich daher vor allem für kleinere Proteine an, für die eine Diffusion durch die Poren der Zellwand möglich ist.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	05.04.2004
Dateien geändert am:	12.02.2007
Promotionsantrag am:	21.01.2004
Datum der Promotion:	21.01.2004