Dokument: Identifizierung von Zielgenen des chimären Transkriptionsfaktors TEL-AML1 (ETV6/RUNX1)

Titel:	Identifizierung von Zielgenen des chimären Transkriptionsfaktors TEL-AML1 (ETV6/RUNX1)
Weiterer Titel:	Identification of target genes of the chimeric transcription factor TEL-AML1 (ETV6/RUNX1)
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=25807
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20130523-094612-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Linka, Yvonne [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,83 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.05.2013 / geändert 17.05.2013
Beitragende:	Prof. Dr. Borkhardt, Arndt [Gutachter] PD Dr. Fleig, Ursula [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Chromosomale Aberrationen wie z. B. Translokationen und die daraus resultierenden Gen-Fusionen spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung onkologischer Erkrankungen. Die reziproke Translokation t(12;21) (p13;q22) ist mit ca. 25% der pädiatrischen Prä B Zell Leukämien assoziiert und damit die häufigste genetische Aberration, die in akuten lymphatischen Leukämien (ALL) des Kindesalters gefunden wird. Sie führt zur Fusion der beiden Transkriptionsfaktoren TEL (ETV6; ETS variant gene 6) und AML1 (RUNX1; runt related transcription factor 1), die beide eine wichtige Rolle in der Hämatopoese spielen. Das Fusionsprotein TEL-AML1 enthält neben der zentralen Region auch die sogenannte pointed Domäne des TEL und bis auf die ersten 21 Aminosäuren alle wichtigen Domänen und Sequenzbereiche des AML1. Bei TEL-AML1 handelt es sich demnach um einen chimären Transkriptionsfaktor, dessen direkte Wechselwirkung mit der DNA durch den AML1-Anteil vermittelt wird, während Protein-Protein-Interaktionen von beiden Proteinen beigesteuert werden. Die Translokation t(12;21) findet bereits in utero statt und erfolgt in einer frühen Vorläuferzelle, welche vermutlich noch nicht auf die B-Zell-Linie festgelegt ist. Interessanterweise lässt sich die Translokation später nur in Prä-B-Zellen nachweisen, was die Vermutung nahe legt, dass sie in den anderen Zell-Linien aus bislang unbekannten Gründen nicht toleriert wird. In Untersuchungen an knock-in Mäusen konnte gezeigt werden, dass TEL-AML1 selbst nicht direkt transformierend wirkt (Fischer et al., 2005), aber Zellen, die diese Translokation tragen, als prä-maligner Klon im Knochenmark persistieren. Die Ansammlung weiterer genetischer Aberrationen, meist u. a. eine Deletion des nicht-translozierten TEL Allels, führt dann vermutlich zur Transformation der Zellen und damit zur Leukämogenese. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die spezifisch durch TEL-AML1 regulierten Gene zu identifizieren und somit Hinweise auf eine mögliche Beteiligung an der Leukämogenese bzw. der Generierung eines prä-leukämischen Klons aufzuklären. Die ersten Untersuchungen fanden in einem induzierbaren murinen Zellsystem statt, welches nach Zugabe von Mifepriston eine starke TEL-AML1 Expression zeigte (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Anthony Ford und Mel Greaves, London). Diese Zellen wurden sowohl für Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) als auch für Genexpressions- und Proteomanalysen mittels stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC) eingesetzt. Für die Verifizierung der Ergebnisse wurden außerdem primäre TEL-AML1-positive Leukämieproben untersucht. Die auf diese Weise identifizierten, exklusiven TEL-AML1 Zielgene regulieren Gene, welche u. a. an biologischen Prozessen wie der negativen Transkriptionsregulation, der Lymphocytendifferenzierung, der positiven Regulation der Signaltransduktion, der RNA-Prozessierung, und der Organisation des Chromatins beteiligt sind. Auch wenn keines dieser Gene bereits als Auslöser für die Enstehung einer akuten Prä-B-Zell Leukämie beschrieben wurde, so lässt die Gesamtheit der durch die TEL-AML1 Expression betroffenen Stoffwechselwege doch vermuten, dass ihre veränderte Regulation bzw. Funktionsweise zu einer Transformation der Zellen beiträgt. Der Vergleich der mittels ChIP und Genexpressions-analyse nachgewiesenen Zielgene mit den in Genexpressionsprofilen TEL-AML1-positiver Patienten differentiell exprimierten Gene lieferte 39 übereinstimmende, gleichsinnig regulierte Gene, von denen mindestens drei (CDP, ORC1 und SNIP1) bereits im Zusammenhang mit malignen Transformationen beschrieben wurden. Wie bereits erwähnt erfolgt die Translokation t(12;21) bereits in utero, so dass die betroffenen Zellen über einen Zeitraum von mehreren Jahren TEL-AML1 exprimieren bevor es zur Ausbildung einer Leukämie kommt. Daher wurden zudem stabil exprimierende humane B-Vorläuferzell-Linien für die Expression von AML1, TEL und TEL-AML1 generiert und ebenfalls die exklusiven durch TEL-AML1 regulierten Zielgene mittels ChIP und Genexpressionsanalysen identifiziert. Diese waren hauptsächlich an biologischen Prozessen wie der Regulation der Apoptose, der negativen Regulation der Zellproliferation, dem Vesikel-vermittelten Transport, der Regulation der Proteinlokalisation und der Regulation der Gen-spezifischen Transkription beteiligt. Ein Vergleich mit Genexpressionprofilen TEL-AML1-positiver Patienten ergab 43 übereinstimmende, gleichsinnig regulierte Gene, von denen mindestens drei (EAF2, LGR5 und NUAK1) bereits mit malignen Transformationen in Verbindung gebracht werden konnten. Insgesamt legen die in dieser Arbeit aufgedeckten TEL-AML1 Zielgene den Schluss nahe, dass die Expression von TEL-AML1 die betroffenen Zellen anfälliger für das Anhäufen weiterer schädlicher Aberrationen macht indem i) die Kontrolle von Proliferation und Differenzierung beeinträchtigt wird, ii) die Transkription und die Proteinlokalisation fehlreguliert werden und iii) die Organisation des Chromatins verändert wird. Die Schnittmenge der sowohl im murinen als auch im humanen Zellsystem sowie in den TEL-AML1-positiven Patienten identifizierten, misregulierten Zielgene enthielt lediglich ein Gen, CENP-P (centromere protein p), welches allerdings im humane Zellsystem eine Herunterregulation zeigte während es im murinen Zellsystem und den Patienten hochreguliert exprimiert war. Dennoch handelt es sich um ein interessantes Zielgen, dessen genauere Bedeutung für die TEL-AML1-induzierte Leukämogenese genauer untersucht werden sollte, da in den Genexpressionsprofilen der TEL-AML1-positiven Patienten insgesamt zehn Centromer-proteine eine signifikante Misregulation zeigten; interessanterweise waren alle hochreguliert. Ein Vergleich der TEL-AML1 regulierten Zielgene mit denen des Wildtyp-AML1 zeigte kein auffällig hohes Maß an Übereinstimmung, auch wenn durch TEL-AML1 gebundene und angereicherte Promotorbereiche zumeist mit vorhergesagten AML1-Bindestellen auf der DNA kolokalisierten. Daher liegt die Vermutung nahe, dass TEL-AML1 zwar über die noch vorhandene DNA-Bindedomäne des AML1 an die DNA bindet, dabei aber größtenteils Gene reguliert, die zumindest im gegebenen Zellkontext bzw. Differenzierungsstadium nicht oder nicht mehr von AML1 reguliert werden. Chromosomal aberrations like translocations leading to fusion of two different genes play an important role in the development of malignant diseases. The reciprocal translocation t(12;21) (p13;q22) is the most common structural chromosomal alteration in pediatric cancer as it occurs in approximately 25% of B-cell precursor acute lymphoblastic leukemias (ALL). It leads to in frame fusion of two transcription factors, namely TEL (ETV6; ETS variant gene 6) and AML1 (RUNX1; runt-related transcription factor 1), both known to be involved in hematopoiesis. The resulting fusion protein TEL-AML1 contains the central and the pointed domain of TEL and, except the first 21 aminoacids, the entire sequence of AML1. Therefore it is expected that DNA-binding of the chimeric transcription factor TEL-AML1 is mediated by the AML1 fraction whereas both protions contribute to protein-protein-interactions. The translocation t(12;21) already occurs in utero, presumably in an early progenitor cell which is not commited to the B-cell lineage, yet. Interestingly, it can only be detected in pre-B-cells later on leading to the assumption that it might not be tolerated by other lineages for unknown reason. Experiments with knock-in mice showed no transforming potential for TEL-AML1 itself (Fischer et al., 2005), but cells carrying the translocation persist as premalignant clones in the bone marrow. Accumulation of further genetic aberrations, mainly deletion of the residual wildtype TEL allel, results in malignant transformation and development of overt leukemia. The purpose of the present work was to identify direct target genes that are regulated by TEL-AML1 and could help elucidating the putative role of TEL-AML1 for leukemogenesis and the establishment of a preleukemic clone. To address this issue an inducible murine pro-B-cell system developed from the BA/F3 cell line (kindly provided by Anthony Ford and Mel Greaves, London) was used, expressing high levels of TEL-AML1 after mifepriston treatment. Cells were subjected to several state-of-the-art genome-wide screening methods, namely ChIP-on-chip, gene expression arrays and stable isotope labelling by amino acids in cell culture (SILAC). Furthermore, primary material of TEL-AML1-positive patients was analysed for verification of gained results. The correlation of the generated data helped to unveil global biological processes affected by TEL-AML1 expression, e. g. negative regulation of transcription, lymphocyte differentiation, positive regulation of signal transduction, RNA processing and chromatin organisation. As no target gene commonly known for its oncogenic potential was found to be regulated by TEL-AML1, one could assume that the observed alterations on one hand do not promote onset of overt leukemia in affected cells by themselves. But on the other hand, these changes may contribute to the establishment of a latent cell reservoir prone for the accumulation of further mutations required for complete malignant transformation. The comparison of TEL-AML1 regulated target genes found in ChIP-on-chip and gene expression analysis with gene expression profiles obtained from TEL-AML1-positive patients revealed 39 differentially expressed genes showing concordant regulation. From these genes at least three (CDP, ORC1 and SNIP1) were previously described in context with malignant transformation. As mentioned above the translocation t(12;21) occurs in utero and affected cells express TEL-AML1 several years before emergence of overt leukemia Therefore stable B-precursor cell lines were generated expressing either AML1, TEL or TEL-AML1 and subjected to ChIP-on-chip and gene expression analysis to identify exclusive TEL-AML1 regulated target genes. These were mainly invoved in biological processes like regulation of apoptosis, negative regulation of proliferation, vesicle-mediated transport, regulation of protein localisation and regulation of gene-specific transcription. Again the TEL-AML1 regulated target genes found in ChIP-on-chip and gene expression analysis were compared with gene expression profiles obtained from TEL-AML1-positive patients and identified 43 differentially expressed genes showing concordant regulation. At least three of these genes (EAF2, LGR5 and NUAK1) were previously described in context with malignant transformation. Altogether, the TEL-AML1 regulated target genes identified in this work suggest that expression of TEL-AML1 renders the affected cells prone for accumulation of further harmful aberrations by i) impairing control mechanisms of differentiation and proliferation, ii) misregulating biological processes like transcription and protein localisation, and iii) altering chromatin organisation. The intersection of misregulated genes identified in the murine and human cell-lines as well as in TEL-AML1-positive patients contained only one gene, CENP-P (centromere protein p), showing a contrarious regulation in the human cell line compared to the murine cell system and patients. However, CENP-P seems to be an interesting target gene whose attendance in TEL-AML1-induced leukemogenesis should be further investigated, especially because ten centromere proteins in total were found to be significantly upregulated in TEL-AML1-positive patients. Surprisingly, the comparison of TEL-AML1 target genes with those of AML1 displayed no striking degree of accordance, although promoterregions bound by TEL-AML1 mostly colocalised with predicted AML1 binding sites. This observation suggests that binding of TEL-AML1 to DNA is carried out by the corresponding domain of the AML1 portion, but largely regulates genes that are no AML1 target genes in the particular cellular context or differentiation stage.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	23.05.2013
Dateien geändert am:	23.05.2013
Promotionsantrag am:	11.04.2012
Datum der Promotion:	05.06.2012